基于兔脂肪干細(xì)胞+Ⅰ型膠原凝膠+PLGA-β-TCP支架的新型骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建以及修復(fù)自體橈骨缺損的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在矯形外科領(lǐng)域，因創(chuàng)傷、腫瘤、感染等原因?qū)е碌墓钦垡约肮侨睋p的重建常常需要外科手段的干預(yù)。到目前為止，在諸多的治療方法中，自體松質(zhì)骨移植仍被認(rèn)為是骨缺損治療的金標(biāo)準(zhǔn)。但是松質(zhì)骨移植存在一些缺點(diǎn)，例如供區(qū)組織有限，增加患者手術(shù)痛苦與風(fēng)險等。特別是在針對大段骨缺損的修復(fù)時，這些問題顯得尤為突出，這無疑限制了自體松質(zhì)骨移植技術(shù)在臨床中的應(yīng)用。近年來，隨著組織工程研究的興起，嘗試通過構(gòu)建骨組織工程復(fù)合體來修復(fù)骨缺損逐漸成為研究的熱點(diǎn)。組織工程的

2、核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體。因此在本課題中，我們探討了一種新型來源干細(xì)胞－脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、多向分化鑒定以及體外成骨誘導(dǎo)分化潛能，通過使用I型膠原凝膠懸浮脂肪干細(xì)胞進(jìn)而與一種新型三維多孔支架材料PLGA-β-TCP復(fù)合從而設(shè)計構(gòu)建了一種新型的仿生骨組織工程復(fù)合體，并通過體外、異位成骨分化研究以及進(jìn)一步用于骨缺損修復(fù)治療，從而對其潛在的臨床應(yīng)用價值進(jìn)行了詳細(xì)、充分的檢測、評估。本課題主要從以下三個方面進(jìn)行了研究：

3、 1、兔脂肪干細(xì)胞（rabbit adipose-derived stem cells, rADSCs）的體外分離培養(yǎng)鑒定及成骨誘導(dǎo)分化研究 自3月齡成年日本大耳白兔肩胛間區(qū)分離獲取皮下脂肪組織，用I型膠原酶消化獲得rADSCs。STRO-1蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定所獲細(xì)胞的干細(xì)胞性質(zhì)；分別加入條件培養(yǎng)液對所獲細(xì)胞進(jìn)行骨、軟骨、脂肪多向誘導(dǎo)分化鑒定；其中在成骨條件培養(yǎng)液作用下，對rADSCs的體外成骨誘導(dǎo)分化潛能進(jìn)行充分的

4、評估，依次進(jìn)行形態(tài)學(xué)、I型膠原、堿性磷酸酶及鈣鹽沉積相關(guān)檢測。 結(jié)果顯示原代所獲細(xì)胞的STRO-1蛋白表達(dá)陽性，進(jìn)一步多向誘導(dǎo)分化鑒定證實(shí)rADSCs具有骨、軟骨、脂肪多向分化能力。此外，在成骨誘導(dǎo)分化過程中，成骨過程階段性特異性標(biāo)記物： I型膠原、堿性磷酸酶及鈣鹽沉積均呈陽性表達(dá)。因此，在兔皮下脂肪組織中分離得到了具有多向分化能力的干細(xì)胞，并展現(xiàn)出了良好的成骨分化潛能，為骨組織工程提供了一種新的種子細(xì)胞。 2、基于

5、兔脂肪干細(xì)胞+I型膠原凝膠+PLGA-β-TCP的新型仿生骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建及其體外、體內(nèi)成骨分化研究 使用I型膠原凝膠將第三代rADSCs懸浮并與PLGA-β-TCP支架復(fù)合，設(shè)計構(gòu)建成含有rADSCs、I 型膠原凝膠以及PLGA-β-TCP支架的骨組織工程復(fù)合體（ rADSCs-COL/PLGA-β-TCP ），同時設(shè)立單純細(xì)胞與材料復(fù)合體組（ rADSCs/PLGA-β-TCP ）、無細(xì)胞I 型膠原凝膠與材料復(fù)合體組（

6、COL/PLGA-β-TCP）以及空白材料（PLGA-β-TCP）作為對照。在體外于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)2w后移植于自體兩側(cè)股部肌袋以檢測其體內(nèi)成骨分化情況。移植8w后處死動物，依次進(jìn)行X線拍片檢查以及組織學(xué)染色分析。堿性磷酸酶活性以及細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度相關(guān)檢測顯示，rADSCs-COL/PLGA-β-TCP 復(fù)合體組成骨分化潛能遠(yuǎn)優(yōu)于rADSCs/PLGA-β-TCP復(fù)合體組。在異位成骨實(shí)驗(yàn)中，放射學(xué)檢測提示rADSCs-COL/PL

7、GA-β-TCP 復(fù)合體組移植物均呈高密度鈣化影，而rADSCs/PLGA-β-TCP復(fù)合體組沒有明顯的鈣化組織形成（n=4）。此外，COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體組、PLGA-β-TCP復(fù)合體組亦無影像學(xué)陽性表現(xiàn)（資料未提供）。HE染色顯示在rADSCs-COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體中新生骨組織均勻充滿于材料孔隙中，而在rADSCs/PLGA-β-TCP復(fù)合體中，僅僅在少數(shù)孔隙中可以看到新生骨組織，大部分孔隙并沒有組織長入，

8、而且由于材料的降解已經(jīng)發(fā)生坍塌（n=4）。此外，在COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體組以及PLGA-β-TCP單純材料組沒有觀察到新生骨形成。組織學(xué)半定量分析提示，rADSCs-COL/PLGA-β-TCP 復(fù)合體組新生骨組織面積比例要遠(yuǎn)高于rADSCs/PLGA-β-TCP復(fù)合體組（p < 0.05, n = 4）。 綜上所述，體外成骨分化研究以及體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)顯示，I型膠原凝膠能夠有效促進(jìn)rADSCs在PLGA-β-TC

9、P 材料中的成骨分化以及均質(zhì)骨組織的形成。rADSCs-COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體作為新生仿生骨組織工程復(fù)合體為骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建提供了一條新的思路。 3、應(yīng)用新型仿生rADSCs-COL/PLGA-β-TCP 骨組織工程復(fù)合體修復(fù)兔自體橈骨缺損 為了進(jìn)一步觀察新型仿生rADSCs-COL/PLGA-β-TCP骨組織工程復(fù)合體的成骨潛能，在本實(shí)驗(yàn)中我們嘗試將rADSCs-COL/PLGA-β-TCP骨組織工

10、程復(fù)合體用于修復(fù)自體橈骨1.5cm骨缺損模型。首先于兔兩側(cè)橈骨建立1.5cm骨缺損模型，分別植入rADSCs-COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體、rADSCs/PLGA-β-TCP復(fù)合體、COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體、單純PLGA-β-TCP材料，同時設(shè)立空白對照，動物樣本總量為30 只。分別于術(shù)后12w、24w、36w取材，行X線拍片檢測并對結(jié)果做Lane-Sandhu X線評分。此外，對于術(shù)后36w所取組織還要進(jìn)行microC

11、T掃描檢查。然后將組織進(jìn)行脫鈣處理后石蠟切片，依次行HE染色以及改良麗春紅三色法染色，并對新生骨組織形成情況以及材料降解情況進(jìn)行半定量分析。X線拍片顯示，rADSCs-COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體組骨缺損修復(fù)效果最為理想，并于術(shù)后36w 得到完全修復(fù)（ n=4 ），而rADSCs/PLGA-β-TCP 復(fù)合體組、COL/PLGA-β-TCP 復(fù)合體組、單純PLGA-β-TCP材料組骨缺損并未得到任何程度的修復(fù)（n=4）。通過對術(shù)后

12、36w所取標(biāo)本進(jìn)行microCT掃描檢測也進(jìn)一步證實(shí)了rADSCs/PLGA-β-TCP復(fù)合體組骨缺損得到了完全修復(fù)。此外，對各組Lane-Sandhu X線評分進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析可以看出，rADSCs-COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體組骨缺損修復(fù)效果要明顯高于其他四組（p < 0.05，n=4）。組織學(xué)觀察結(jié)果與放射學(xué)檢測相類似，在rADSCs-COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體組，術(shù)后12w新生骨組織均勻的分布于材料孔隙內(nèi)（n=4）；

13、術(shù)后24w骨斷端的連續(xù)性已經(jīng)基本恢復(fù)，但髓腔尚未再通，在髓腔內(nèi)還可見材料殘余（n=4）；術(shù)后36w，骨斷端的連續(xù)性已經(jīng)完全恢復(fù)，髓腔已經(jīng)基本再通（ n=4 ）。而rADSCs/PLGA-β-TCP 復(fù)合體組、COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體組、單純PLGA-β-TCP材料組并沒有觀察到有明顯的新生骨組織長入（n=4）。組織學(xué)半定量分析提示rADSCs-COL/PLGA-β-TCP復(fù)合體組的新生骨組織面積比例以及材料降解速率均顯著高于其