脂肪干細胞復合SDF-1-雙層PLGA支架修復軟骨缺損的研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨在關(guān)節(jié)負重和運動中起著十分重要的作用，同時它也是關(guān)節(jié)內(nèi)骨折中最易損傷的結(jié)構(gòu)。成熟的軟骨細胞特別是透明軟骨細胞再生能力較弱，一旦軟骨細胞受到破壞將加速軟骨細胞凋亡的發(fā)生，形成局部軟骨缺損，易出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎，引發(fā)疼痛、關(guān)節(jié)畸形及殘疾，嚴重影響患者的健康和生活。目前臨床上采用了多種方法治療軟骨缺損，但治療效果尤其是長期效果不穩(wěn)定。近年來，組織工程技術(shù)的發(fā)展，為解決軟骨損傷的修復這一難題提供了可能性，來源于各種組織的間充質(zhì)干細胞被用于組

2、織工程修復的種子細胞，其中脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(ADSCs)因其來源廣泛、在機體內(nèi)性能和含量穩(wěn)定、對機體損傷很小、培養(yǎng)條件較簡單、增殖能力較強等特點，日益受到學者們的關(guān)注。干細胞被證實可向機體受損部位遷移，這種遷移活動與多種趨化因子密切相關(guān)。基質(zhì)細胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是由骨髓基質(zhì)細胞及其它相關(guān)的間皮細胞和上皮細胞分泌的一種趨化蛋白，是已知的干細胞遷移的主要趨化因子，在

3、干細胞的動員和歸巢起了關(guān)鍵性的作用。SDF-1的生物學功能復雜，廣泛參與細胞發(fā)育、調(diào)控干細胞的遷移并與惡性腫瘤的生長轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。最近的研究顯示，與SDF-1野生型小鼠相比，SDF-1-/-小鼠胚胎的肱骨長度明顯短縮，組織學分析表明，SDF-1在肥大前期和肥大期的軟骨細胞內(nèi)均有表達，說明SDF-1在調(diào)控軟骨細胞分化成熟過程中也扮演著十分重要的作用。我們認為，SDF-1的上述對于細胞誘導趨化及對軟骨細胞分化調(diào)控的作用使得其在軟骨缺損再生修

4、復中可能存在有廣闊的應用空間，因此，我們設(shè)計了此項研究。本課題擬將SDF-1整合至PLGA支架中，使其在體內(nèi)局部釋放，然后復合脂肪來源的干細胞修復軟骨缺損，SDF-1可以使移植和體內(nèi)來源的干細胞遷移至缺損部位，從而促進軟骨再生，同時采用熒光標記示蹤移植的ADSCs。實驗分為三部分:(1)兔ADSCs的培養(yǎng)、鑒定及SDF-1對ADSCs的增殖、分化作用;(2)雙層PLGA支架制作及SDF-1/PLGA支架對ADSCs增殖、分化的影響;(3

5、)載有ADSCs的SDF-1/PLGA復合體修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究。
　　第一部分兔ADSCs的培養(yǎng)、鑒定及SDF-1對ADSCs的增殖、分化作用
　　目的:觀察SDF-1在2D下對ADSCs增殖、分化的作用，尋找一種最優(yōu)的SDF-1濃度。
　　方法:取成年新西蘭兔頸部皮下脂肪，用酶消化、梯度離心、貼壁培養(yǎng)法對兔ADSCs進行分離、培養(yǎng)并鑒定。取第三代ADSCs，用含不同濃度的SDF-1(0μg/L、1μg/L、10

6、μg/L、100μg/L、200μg/L)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，MTT方法檢測細胞增殖，RT-PCR方法檢測ADSCs的CXCR4表達情況，同時采用Transwell方法檢測ADSCs在不同濃度SDF-1作用下的遷移作用。
　　結(jié)果:陽性標志物CD105，CD73，CD90，CD166，CD29，CD44在ADSCs中均有強陽性＞90％的陽性表達，而且ADSCs可以向骨、軟骨、脂肪方向三系分化。SDF-1能促進ADSCs增殖、CXCR4

7、的基因表達及ADSCs的遷移，而且具有濃度依賴性，隨著濃度升高，作用增強。與同等濃度SDF-1組相比，經(jīng)anti-CXCR4處理后ADSCs增殖、CXCR4表達及遷移均降低，仍高于正常對照組。
　　結(jié)論:SDF-1可以促進ADSCs增殖和遷移，并且隨著濃度升高，其作用增強;SDF-1可能通過上調(diào)CXCR4的表達并與之結(jié)合在促進ADSCs的體外增殖和遷移中起關(guān)鍵作用;SDF-1促進ADSCs的增殖和遷移作用中可能存在的信號分子機制仍

8、需進一步的研究。
　　第二部分雙層PLGA支架制作及SDF-1/PLGA支架對ADSCs增殖、分化的影響
　　目的:觀察SDF-1從PLGA支架中的釋放效率及在3D環(huán)境下SDF-1對ADSCs增殖、分化的影響。
　　方法:用明膠顆粒作為致孔劑，利用致孔劑浸出技術(shù)制作雙層PLGA支架。將SDF-1溶液(100ng/ml)30μl加入到PLGA支架上，利用ellisa試劑盒檢測不同時間點SDF-1釋放情況，計算其累積釋放效

9、率;同時將ADSCs種植于支架上，研究在3D環(huán)境下，緩釋的SDF-1對ADSCs的增殖及CXCR4基因的表達情況。
　　結(jié)果:我們制作的PLGA支架具有致密層和疏松層，即具有大、小兩層微孔，大孔直徑在400μm和小孔直徑150μm左右。ADSCs在支架大孔壁上鋪展良好，激光共聚焦顯微鏡顯示ADSCs在支架上有很好的活性。SDF-1能從SDF-1/PLGA支架中緩慢釋放，在第一天，大約60％的SDF-1從PLGA支架中釋放，此后維持

10、穩(wěn)定速度釋放，在第30天，仍能檢測到SDF-1的釋放;而且從PLGA支架緩慢釋放的SDF-1能促進ADSCs的CXCR4的表達，與平面培養(yǎng)相比，在3D環(huán)境下ADSCs的CXCR4的表達明顯增加。
　　結(jié)論:ADSCs在SDF-1/PLGA支架上能良好的生長;SDF-1能有效的從PLGA支架中釋放，而且同2D環(huán)境下比較，在3D下體外釋放的SDF-1更能促進ADSCs的CXCR4表達，將進一步促進ADSCs遷移和歸巢，在軟骨缺損的再生

11、修復中有廣闊的應用空間。
　　第三部分載有ADSCs和SDF-1的PLGA復合體修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究
　　目的:探索ADSCs聯(lián)合具有緩釋作用的SDF-1/PLGA支架能協(xié)調(diào)作用促進兔關(guān)節(jié)軟骨的修復，延緩再生軟骨的退變，探討移植的同種異體的ADSCs在體內(nèi)能夠存活。
　　方法:取48只新西蘭大白兔，在股骨髁髕股關(guān)節(jié)部位制作關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。隨機分為3組，每組16只，分別為PLGA組，ADSCs/PLGA組，SDF-

12、1/ADSCs/PLGA組。各組分別于術(shù)后第6周和第12周收取包含修復組織的股骨髁，進行形態(tài)學、組織學觀察。并在12周用RT-qPCR檢測修復組織中Aggrecan，Sox9，Collagen typeⅠ，Ⅱ和Ⅹ等基因表達情況，利用confocal和熒光追蹤的方法評估移植的ADSCs的存活情況。
　　結(jié)果:和PLGA組、ADSCs/PLGA組相比，SDF-1/ADSCs/PLGA組有最多的再生軟骨和GAG含量，其ICRS評分和再生

13、組織的彈性模量顯著高于其余兩組(P＜0.05);進一步的再生組織的相關(guān)基因的檢測顯示:SDF-1/ADSCs/PLGA組的軟骨向Aggrecan，SOX9，Collagen typeⅡ基因的量顯著高于其余兩組(P＜0.05)，而collagentypeⅠ、Ⅹ的表達顯著低于其余兩組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:載有SDF-1的雙層PLGA支架聯(lián)合ADSCs能有效的促進關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生修復和界面整合，提高軟骨修復質(zhì)量，而且移植的同種