脂肪干細(xì)胞聯(lián)合TGF-β3負(fù)載的PLGA支架修復(fù)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、軟骨損傷在臨床上十分常見，其治療長期以來一直是骨科領(lǐng)域的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問題。成年人發(fā)生軟骨損傷后，由于自然修復(fù)的軟骨組織為纖維軟骨而非功能性的透明軟骨，因而不可避免出現(xiàn)漸進(jìn)性退變，最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。目前對于軟骨缺損的治療措施主要是疼痛控制、手術(shù)干預(yù)和軟骨移植，但這些治療方法的遠(yuǎn)期療效并不理想。在這種情況下，作為一種可選擇的替代療法，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程方法為軟骨缺損的修復(fù)開辟了一條全新的途徑。一般來講，利用組織工程方法進(jìn)行軟骨缺損

2、的修復(fù)需要具備三個(gè)主要條件:第一，足夠數(shù)量、功能正常、具有成軟骨分化能力的種子細(xì)胞;第二、具有良好生物相容性、可無毒降解、合適空隙大小和孔隙率的三維支架;第三、調(diào)節(jié)種子細(xì)胞增殖、分化，并維持其表型特征的細(xì)胞因子。
　　脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)是來自中胚層的成體干細(xì)胞，由于其相比其他成體干細(xì)胞來源充足、取材方便、提取時(shí)對機(jī)體損傷小，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

3、(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有相似的生物學(xué)特征和分化潛能，以及優(yōu)于BMSCs的增殖能力，現(xiàn)已成為一種理想的種子細(xì)胞來源，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。聚乳酸-聚羥乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA)作為被美國食品和藥品管理局(Food AndDrug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)可以用于人體的組織工程支架材料，以其良好的生物相容性

4、，來源廣泛、容易獲得且可大批量生產(chǎn)，其空間結(jié)構(gòu)、大體形態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度、降解時(shí)間等都能預(yù)先設(shè)計(jì)和調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，已成為在組織工程中應(yīng)用最廣泛的支架材料。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）是一種細(xì)胞生長和細(xì)胞外基質(zhì)合成的多功能調(diào)節(jié)器，它可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，增加蛋白多糖和二型膠原合成，而且還能減少軟骨膠原酶的表達(dá)和分泌。有研究認(rèn)為TGF-β3相比于TGF-β1具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化

5、的能力，而且TGF-β3同時(shí)還有抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制劑表達(dá)的作用。
　　雖然AMSCs已經(jīng)被證實(shí)具有修復(fù)軟骨缺損的作用，但應(yīng)用非誘導(dǎo)的AMSCs進(jìn)行軟骨缺損修復(fù)的研究尚顯不足，而且非誘導(dǎo)的AMSCs在植入體內(nèi)后是否能長期存活以及是否通過直接分化為軟骨細(xì)胞對缺損部位進(jìn)行修復(fù)，這些問題都尚不明確。目前尚沒有應(yīng)用AMSCs聯(lián)合TGF-β3負(fù)載的雙層PLGA進(jìn)行全層軟骨缺損修復(fù)的研究報(bào)道。在本研究中，我們在體外實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研

6、究結(jié)果基礎(chǔ)上，用超順磁氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）作為示蹤劑，用SPIO標(biāo)記的AMSCs聯(lián)合TGF-β3負(fù)載的雙層PLGA三維支架構(gòu)筑AMSCs/TGF-β3/PLGA復(fù)合體，觀察其對兔全層關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的效果，并用核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)對植入的AMSCs進(jìn)行活體內(nèi)追蹤，觀察其存活和分布情況，同時(shí)用普魯士藍(lán)染色檢測新生的軟骨細(xì)胞是否由

7、植入的AMSCs直接分化而來。
　　本研究主要分三部分:(1)首先進(jìn)行兔AMSCs的分離、培養(yǎng)和SPIO標(biāo)記;體外檢測MRI對SPIO標(biāo)記的AMSCs探測的敏感性。同時(shí)利用致孔劑浸出技術(shù)制作雙層PLGA三維支架。結(jié)果顯示SPIO可以高效的標(biāo)記AMSCs;在被標(biāo)記的AMSCs達(dá)到足夠的濃度的時(shí)候，可以被MRI敏感的追蹤到。電鏡掃描(scanning electronmicroscopy, SEM)結(jié)果證實(shí):利用致孔劑浸出技術(shù)可以成功

8、制作滿足組織工程需要，具有適合孔徑大小的雙層PLGA三維支架。(2)檢測TGF-β3對體外培養(yǎng)的AMSCs增殖、分化的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為TGF-β3濃度在10ng/ml時(shí)，短期內(nèi)對體外單層培養(yǎng)的AMSCs的增殖沒有影響。用TGF-β3對體外單層和三維培養(yǎng)的AMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)可以增加二型膠原(Collagen typeⅡ)，聚糖蛋白(Aggrecan)和SOX-9(SRY-related HMGbox9，SOX-9)在基因和蛋白水

9、平的表達(dá)，這種作用呈時(shí)間依賴性，但三維培養(yǎng)條件下相比單層培養(yǎng)更有利于促進(jìn)它們在基因和蛋白水平的表達(dá)。(3)在前兩部分的基礎(chǔ)上，用AMSCs/TGF-β3/PLGA復(fù)合體對兔子全層軟骨缺損模型進(jìn)行修復(fù)，觀察其修復(fù)效果，AMSCs在體內(nèi)的存活情況以及新生軟骨細(xì)胞是否直接由其分化而來。結(jié)果表明AMSCs/TGF-β3/PLGA復(fù)合體可有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損;AMSCs在植入體內(nèi)12周后仍然有部分存活，但新生的軟骨細(xì)胞并非由植入體內(nèi)的AMSCs直

10、接分化而來。
　　第一部分、AMSCs的超順磁氧化鐵標(biāo)記和雙層PLGA支架的制作
　　目的:觀察MRI對SPIO標(biāo)記的AMSCs探測的敏感性以及致孔劑浸出技術(shù)能否成功制作符合軟骨組織工程需要的合適孔徑大小的作雙層PLGA三維支架。
　　方法:用含SPIO為25μg/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)AMSCs，24h后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，光鏡下觀察AMSCs被SPIO標(biāo)記的情況，胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞，分別檢測細(xì)胞濃度在5×1

11、04，1×105，5×105，1×106/ml時(shí)MRI對被標(biāo)記細(xì)胞的敏感性。用明膠顆粒作為致孔劑，利用致孔劑浸出技術(shù)制作雙層PLGA支架。
　　結(jié)果:用含SPIO為25μg/ml的培養(yǎng)基對AMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，AMSCs可以被高效標(biāo)記，標(biāo)記率接近100％。在被標(biāo)記的AMSCs濃度達(dá)到1×105/ml時(shí)，MRI即可探測信號的改變，1×106/ml時(shí)T2加權(quán)像上呈現(xiàn)黑色。SEM掃描結(jié)果表明利用致孔劑浸出技術(shù)可成功制作具有大、小兩層微孔，

12、孔徑分別在200μm和400μm左右的符合組織工程需要的雙層PLGA三維支架。
　　結(jié)論:SPIO可以高效標(biāo)記AMSCs并被MRI追蹤到。以明膠作為致孔劑利用致孔劑浸出技術(shù)可成功制作符合組織工程需要的雙層PLGA三維支架。
　　第二部分、TGF-β3對體外培養(yǎng)的AMSCs增殖、分化的影響
　　目的:觀察TGF-β3對體外培養(yǎng)的AMSCs增殖、分化的影響。
　　方法:取成年新西蘭兔腹股溝部皮下脂肪，用酶消化、梯度離

13、心、貼壁培養(yǎng)法對兔AMSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)。取第三代AMSCs，用含不同濃度的TGF-β3(0，1，5，10，20，50 ng/ml)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，CCK-8方法檢測不同濃度TGF-β3在第1、3、7天對AMSCs增殖的影響。用10ng/ml TGF-β3誘導(dǎo)AMSCs，分別于誘導(dǎo)后7天和14天，免疫熒光觀察Collagen typeⅡ的表達(dá)情況;實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-timequantitative polymerase

14、chain reaction，RT-qPCR)法檢測細(xì)胞中Aggrecan，CollagentypeⅡ，SOX-9基因的表達(dá)，western blot法檢測細(xì)胞中Aggrecan，Collagen typeⅡ，SOX-9蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:用含不同濃度TGF-β3的培養(yǎng)基培養(yǎng)1、3天后，均對AMSCs的增殖均沒有影響，7天后，除10ng/ml濃度組對AMSCs的增殖沒有影響外，其余濃度均明顯抑制了AMSCs的增殖。免疫熒光結(jié)果

15、顯示用10ng/ml的TGF-β3誘導(dǎo)7天后，AMSCs表達(dá)Collagen typeⅡ，第14天熒光信號強(qiáng)度顯著高于第7天，單純低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)AMSCs14天后也有少量的Collagen typeⅡ表達(dá)。RT-qPCR和westernblot結(jié)果表明用TGF-β3對體外單層和三維培養(yǎng)的AMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)可以增加Collagen typeⅡ，Aggrecan和SOX-9在基因和蛋白水平的表達(dá)，這種作用呈時(shí)間依賴性，三維培養(yǎng)條件下三者在

16、基因和蛋白水平的表達(dá)顯著高于單層培養(yǎng)。
　　結(jié)論:10ng/ml的TGF-β3短期內(nèi)對體外培養(yǎng)的AMSCs的增殖沒有影響。TGF-β3可誘導(dǎo)AMSCs向軟骨分化，呈時(shí)間依賴性，三維培養(yǎng)優(yōu)于單層培養(yǎng)。
　　第三部分、AMSCs/TGF-β3/PLGA復(fù)合體修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察AMSCs/TGF-β3/PLGA復(fù)合體對兔子全層關(guān)節(jié)軟骨缺損模型的修復(fù)作用及AMSCs在這一過程中的作用和機(jī)制。

17、　　方法:取64只新西蘭大白兔，在股骨髁髕股關(guān)節(jié)部位制作關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。隨機(jī)分為4組，每組16只，分別為缺損組（Defect組），PLGA組，TGF-β3/PLGA組，AMSCs/TGF-β3/PLGA組。各組分別于術(shù)后第6周和第12周對32只兔的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行MRI掃描后處死，并收取包含修復(fù)組織的股骨髁，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀察。并用RT-qPCR和western法檢測修復(fù)組織中Aggrecan，SOX-9，Collagen typeⅠ，

18、Ⅱ andⅩ在基因和蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:MRI掃描結(jié)果提示在AMSCs/TGF-β3/PLGA復(fù)合體植入部位，術(shù)后第6周和第12周都可探測到明顯的低信號改變。普魯士藍(lán)染色顯示術(shù)后第6周時(shí)在新生軟骨層和軟骨下骨層均有藍(lán)染顆粒，而在第12周只有軟骨下骨層有藍(lán)染顆粒，而新生軟骨層未見藍(lán)染顆粒。AMSCs、TGF-β3均可促進(jìn)軟骨缺損的修復(fù)，這種作用是通過在基因和蛋白水平調(diào)節(jié)Aggrecan，SOX-9，Collagen type