人臍帶Wharton膠支架負載脂肪干細胞構建新型組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、目的：
　　探索人臍帶Wharton膠支架負載脂肪干細胞構建新型組織工程軟骨的可行性，并評價該組織工程軟骨修復兔膝關節(jié)全層軟骨缺損的效果。
　　方法：
　?、艔耐妙i背部皮下脂肪分離得到脂肪干細胞，培養(yǎng)至P3代后通過流式細胞學鑒定其表面標記物，明確其干細胞來源。⑵普通培養(yǎng)至P3代后更換為誘導液（DMEM中加入10％FBS，10ng/ml TGF-β1，25ng/ml bFGF，10-7M地塞米松）成軟骨方向誘導兩周，收集

2、細胞并調整終濃度為1×107/ml，將細胞接種至Wharton膠支架上繼續(xù)三維誘導一周構建組織工程軟骨。FDA-PI染色及Hoechst33258染色評估細胞在支架上的活力及增殖情況，掃描電鏡觀察細胞在支架上分布及黏附情況，甲苯胺藍、番紅O、Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察細胞外基質分泌情況。⑶于兔膝關節(jié)軟骨滑車處形成1個直徑4mm，深2mm的環(huán)形全層軟骨缺損，設置空白組、單純支架材料組及細胞支架復合體組。術后24周取材，缺損修復區(qū)行大體觀察、

3、組織學染色、糖胺多糖、總膠原含量檢測及生物力學測定分析評價缺損修復情況。
　　結果：
　　⑴流式細胞學鑒定顯示CD73、CD90、CD105陽性，CD34、CD45、HLA-DR陰性，提示所取細胞為脂肪來源干細胞；⑵FDA-PI染色及Hoechst33258染色可見支架上粘附的細胞分布均勻，活細胞較多，死細胞較少，支架深層也有部分細胞粘附。掃描電鏡觀察可見誘導后大量細胞黏附于支架孔隙內，呈圓形或橢圓形。組織學染色陽性提示誘導

4、后細胞分泌大量細胞外基質；⑶術后24周細胞支架復合體組缺損區(qū)大部分被修復，缺損部位被軟骨組織填充，修復區(qū)表面光滑。組織學染色顯示有典型的透明軟骨樣結構，GAG、總膠原定量測定提示可達正常值的90%以上，生物力學測定提示與正常軟骨相似。單純支架材料組雖然缺損區(qū)大部分被修復，但修復區(qū)多為纖維軟骨，僅有少量透明軟骨樣結構?？瞻捉M未能修復關節(jié)軟骨缺損，纖維組織部分填充缺損，表面覆蓋薄層纖維組織。
　　結論：
　　脂肪干細胞作為軟骨組