人臍帶Wharton膠中間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及組織工程軟骨體外構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷是關(guān)節(jié)外科常見(jiàn)的疾病.軟骨由于其自身的解剖特點(diǎn)，損傷后很難自愈，這也是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疾病和關(guān)節(jié)不穩(wěn)的主要原因。目前，關(guān)節(jié)鏡下盥洗術(shù)、微骨折技術(shù)、馬賽克移植術(shù)等治療方法遠(yuǎn)期效果均不滿意，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變和骨性關(guān)節(jié)炎。采用自體軟骨細(xì)胞移植(Autologous chondrocyte implantation，ACI)能夠?qū)崿F(xiàn)透明軟骨或透明樣軟骨修復(fù)，并取得較好的臨床療效。但ACI的缺點(diǎn)是供區(qū)出現(xiàn)新的缺損，需要二次手術(shù)，增加患者

2、的痛苦。采用干細(xì)胞移植治療軟骨缺損是一個(gè)新興的治療手段，并認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是最有希望的干細(xì)胞。MSCs是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的一類多能干細(xì)胞。目前，MSCs主要來(lái)源于骨髓，但獲得骨髓時(shí)造成患者的痛苦，且骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)隨著年齡增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，故尋找一種能替代BMSCs，并可

3、彌補(bǔ)其缺陷干細(xì)胞來(lái)源，已越來(lái)越受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)尚存在定向分化和純化的技術(shù)障礙，且面臨眾多倫理、法律方面的問(wèn)題，也有移植后形成畸胎瘤的報(bào)道，應(yīng)用受到一定限制。臍帶屬于胚胎外組織，是胎兒分娩后的廢棄物，組織來(lái)源廣泛，無(wú)倫理學(xué)限制。臍帶由臍帶外膜、臍動(dòng)脈、臍靜脈以及血管周圍的黏蛋白樣組織，后者被稱為Wharton膠。 本研究目的為探討臍帶Wharton膠中干細(xì)胞作為軟

4、骨組織工程種子細(xì)胞的可行性，并從四個(gè)方面進(jìn)行闡述。第一部分為人臍帶Wharton膠中的基質(zhì)成分定性和定量分析的實(shí)驗(yàn)研究；第二部分為人臍帶臍帶Wharton膠中MSCs的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)性狀的實(shí)驗(yàn)研究；第三部分人臍帶Wharton膠中MSCs向軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究；第四部分為細(xì)胞因子在人臍帶Wharton膠間質(zhì)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞的表達(dá).本研究從組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和組織化學(xué)、基因水平和蛋白表達(dá)水平探討臍帶Wharton膠及Whar

5、ton膠中MSCs的生物學(xué)特性和向軟骨誘導(dǎo)的可行性。 方法：(1)對(duì)臍帶組織進(jìn)行組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色，同時(shí)對(duì)Wharon膠進(jìn)行葡萄糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)和總膠原含量的測(cè)定。(2)從手術(shù)臺(tái)取足月正常產(chǎn)健康產(chǎn)婦臍帶組織，去除臍血管和外膜組織，剝離Wharton膠，采用膠原酶消化法和小組織塊兩種培養(yǎng)方法進(jìn)行原代培養(yǎng)；對(duì)不同代的臍帶MSCs進(jìn)行生長(zhǎng)曲線、表面標(biāo)志、流式細(xì)胞檢測(cè)表面標(biāo)志、成纖維細(xì)胞

6、集落生成單位(Colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)、生長(zhǎng)周期、凍存與復(fù)蘇及逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription-polymerase chain raction，RT-PCR)分析，并進(jìn)行番紅“O”染色、甲苯胺藍(lán)染色以及Ⅱ型膠原免疫組化染色進(jìn)行軟骨特異性標(biāo)志的鑒定。(3)在DMEM中加入10％FBS，10ng/mLTGF-β1，25ng/mL bFGF，10-7M地塞米松作為誘導(dǎo)

7、培養(yǎng)基。采用普通誘導(dǎo)培養(yǎng)、密集誘導(dǎo)培養(yǎng)、結(jié)合生物反應(yīng)器技術(shù)體外構(gòu)建無(wú)支架軟骨組織。成軟骨細(xì)胞表型通過(guò)番紅“O”染色、甲苯胺蘭染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒別。GAGs定量檢測(cè)應(yīng)用二甲基亞甲蘭法，Ⅱ型膠原定量檢測(cè)通過(guò)ELISA法。(4)分別對(duì)人臍帶Wharton膠MSCs、向軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的MSCs以及人軟骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)，比較人臍帶Wharton膠MSCs軟骨誘導(dǎo)前后與正常人軟骨細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)水平，為同種異體移植

8、奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ). 結(jié)果：(1)人臍帶組織富含膠原和GAGs，HE染色發(fā)現(xiàn)Wharton膠中含有大量的間質(zhì)細(xì)胞；(2)采用酶消化法分離可以快速分離Wharton膠中間質(zhì)細(xì)胞，并迅速貼壁生長(zhǎng)；采用組織塊法培養(yǎng)原代培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。流式細(xì)胞檢測(cè)表明這些細(xì)胞表達(dá)CD44、CD105、CD271等MSCs標(biāo)志物；不表達(dá)CD34、CD45等造血等標(biāo)志物；HLA-ABC陽(yáng)性表達(dá)，HLA-DPDQDR陰性表達(dá)。經(jīng)過(guò)凍存復(fù)蘇后免疫表型無(wú)顯著變化。(3)

9、未進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)的細(xì)胞弱表達(dá)軟骨細(xì)胞標(biāo)志，誘導(dǎo)后GAGs和Ⅱ型膠原定量檢測(cè)結(jié)果均顯著高于未誘導(dǎo)細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果顯示人臍帶Wharton膠MSCs誘導(dǎo)前后均表達(dá)SOX-9、Col-2al.人臍帶Wharton膠MSCs經(jīng)密集誘導(dǎo)培養(yǎng)后迅速結(jié)成膜狀；采用密集誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)合生物反應(yīng)器培養(yǎng)體外可以構(gòu)建大塊無(wú)支架組織工程軟骨。(4)采用細(xì)胞因子芯片技術(shù)對(duì)人臍帶Wharton膠MSCs、誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞以及正常軟骨細(xì)胞進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，臍帶Wha

10、rton膠干細(xì)胞以及誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞在軟骨相關(guān)因子表達(dá)水平與軟骨細(xì)胞接近；同時(shí)還表達(dá)腫瘤抑制生長(zhǎng)因子以及某些神經(jīng)生長(zhǎng)因子。 結(jié)論：(1)人臍帶Wharton膠富含膠原和GAGs，具有與軟骨組織相似的細(xì)胞外基質(zhì)；(2)人臍帶Wharton膠中MSCs來(lái)源廣泛，無(wú)倫理學(xué)限制；臍帶Mscs具有間質(zhì)干細(xì)胞的特性，不向造血系分化；(3)臍帶MSCs具有前軟骨細(xì)胞的特性，有望作為軟骨組織工程的新型的種子細(xì)胞。臍帶MSCs密集誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)合旋轉(zhuǎn)