毛囊干細(xì)胞脫細(xì)胞支架復(fù)合物修復(fù)兔膀胱缺損的研究.pdf

1、目的:
　　(1)比較不同毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，建立毛囊干細(xì)胞(Hair follicle stemcells，HFSCs)的體外培養(yǎng)方法，用目前公認(rèn)的標(biāo)記物和其他手段對其進(jìn)行鑒定;
　　(2)尋找標(biāo)記毛囊干細(xì)胞的方法，并用CM-Dil標(biāo)記毛囊干細(xì)胞，探討CM-Dil標(biāo)記毛囊干細(xì)胞的可行性，并觀察標(biāo)記后的毛囊干細(xì)胞與膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)共培養(yǎng)形成的細(xì)胞-支架復(fù)合物的熒光表達(dá)情況，保證移植細(xì)胞的質(zhì)量及標(biāo)記細(xì)胞的示蹤效果;
　　

2、(3)誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化并鑒定，觀察熒光標(biāo)記細(xì)胞-支架復(fù)合物后細(xì)胞生長情況;
　　(4)評估細(xì)胞-支架復(fù)合物對于兔膀胱缺損模型的修補(bǔ)作用，觀察并鑒定細(xì)胞-支架復(fù)合物修補(bǔ)處特異性標(biāo)記物的表達(dá)。
　　方法:
　　(1)選用出生2月的新西蘭兔，經(jīng)過嚴(yán)格消毒擬切除觸須部位后，切取含毛囊的組織，在無菌環(huán)境下使用顯微外科技術(shù)分離出毛囊組織和毛囊外根鞘部。用中性蛋白酶和胰酶消化毛囊外根鞘部;利用差速貼壁法篩選貼壁快的細(xì)胞

3、后，培養(yǎng)的細(xì)胞可供進(jìn)一步傳代或冷凍處理。培養(yǎng)出來的細(xì)胞應(yīng)用倒置顯微鏡、電子顯微鏡、Giemsa染色、免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀等鑒定，將β1整合素、CK15、CD34，CK7等細(xì)胞表面標(biāo)志物作為鑒定依據(jù);
　　(2)分離培養(yǎng)兔毛囊干細(xì)胞并鑒定，取CM-Dil儲存液5ul，用PBS稀釋成1ml的5ug/ml（即5uM）CM-Dil工作液。將貼壁生長、狀態(tài)良好P3代毛囊干細(xì)胞（細(xì)胞總量約為5～6×106）終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸出，用PBS

4、輕洗貼壁細(xì)胞2次，加入5ug/ml(即5uM)CM-Dil工作液，37℃孵育15min，-4℃孵育5min，PBS洗滌兩遍，加入體積為25ml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，第2天換液。倒置相差熒光顯微鏡綠色熒光下進(jìn)行觀察。將第三代MFSCs在轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和骨形態(tài)蛋白4(BMP4)的作用下向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，用細(xì)胞免疫組化的方法檢測平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá);
　　(3)使用CM-Dil標(biāo)記HFSCs并與兔膀胱脫細(xì)胞基

5、質(zhì)共培養(yǎng)成細(xì)胞-支架復(fù)合物，利用熒光倒置顯微鏡觀察標(biāo)記后細(xì)胞及細(xì)胞-支架復(fù)合物，確定熒光標(biāo)記情況;手術(shù)回植細(xì)胞-支架復(fù)合物至兔膀胱缺損模型觀察生長情況;取得實(shí)驗(yàn)動物膀胱，選取修補(bǔ)位置，制成石蠟切片，使用熒光倒置顯微鏡觀察組織切片的熒光表達(dá)，利用免疫組化的方法檢測組織結(jié)構(gòu)成分和平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)第三代HFSCs在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為幼圓鋪路石樣形態(tài)，二步酶法、顯微分離技術(shù)聯(lián)合免疫磁珠法、差速貼

6、壁法能很好的培養(yǎng)出毛囊干細(xì)胞;
　　(2)CM-Dil標(biāo)記的第三代HFSCs熒光表達(dá)穩(wěn)定，與兔膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)共培養(yǎng)得到的細(xì)胞-支架復(fù)合物仍有較強(qiáng)的熒光表達(dá);TGF-β1和BMP4誘導(dǎo)鑒定后確定細(xì)胞的干細(xì)胞功能;HFSCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)7天后，具有平滑肌細(xì)胞特有的“波峰-波谷”樣生長特點(diǎn)。表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物:a-SMA;
　　(3)實(shí)驗(yàn)兔分別于術(shù)后7d、16d各死亡一只，死因?yàn)槁┠?組織切片熒光表達(dá)有所減弱但仍存在，

7、與未修補(bǔ)位置界限較清，Masson染色發(fā)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)齊全，肌纖維表達(dá)明顯，免疫組化表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物:a-SMA。
　　結(jié)論:
　　(1)HFSCs原代獲取后，在體外培養(yǎng)條件下生長良好，并能維持干細(xì)胞的特性，能作為組織工程研究及應(yīng)用的首選種子細(xì)胞;二步酶法、顯微分離技術(shù)聯(lián)合免疫磁珠法、差速貼壁法能很好的培養(yǎng)出毛囊干細(xì)胞;
　　(2)熒光標(biāo)記的HFSCs在體內(nèi)能夠穩(wěn)定表達(dá);TGF-β1和BMP4能使HFSCs向平滑