異體滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞—聚乳酸乙醇酸共聚體復(fù)合物修復(fù)兔股骨髁軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以經(jīng)體外擴(kuò)增的兔異體滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSCs)為種子，加入纖維蛋白凝膠，以聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)為支架，以SMSCs-PLGA復(fù)合物的形式在體外用細(xì)胞因子誘導(dǎo)后進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系，回植入兔體內(nèi)股骨髁軟骨缺損處，探討以此修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的可行性。
　　 方法：通過有限稀釋單克隆培養(yǎng)法將兔的SMSCs由滑膜組織中分離出來加以純化，在體外傳代培養(yǎng)，并研究其形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、增殖動力學(xué)、分子表型、核型以及致瘤性等基本

2、的生物學(xué)特性；同時(shí)將聚乳酸乙醇酸共聚物制備成型，并檢測其生物安全性和組織相容性，評價(jià)其作為種子細(xì)胞支架的可能性和可靠性；將傳代培養(yǎng)到第三代的種子細(xì)胞混合纖維蛋白凝膠，按一定密度注入到成型的聚乳酸乙醇酸共聚物支架中，將復(fù)合物放入生物反應(yīng)器系統(tǒng)，加入BMP-2、TGF-β3和DEX誘導(dǎo)培養(yǎng)進(jìn)入軟骨分化譜系，以RT-PCR檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色檢測細(xì)胞分化過程中Ⅰ、Ⅱ型

3、膠原的表達(dá)，堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色檢測軟骨特異性糖胺聚糖(GAG)的表達(dá)，以此來判斷BMP-2、TGF-β3和DEX是否能夠誘導(dǎo)SMSCs進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系；最后將經(jīng)體培養(yǎng)擴(kuò)增28天的種子細(xì)胞支架復(fù)合物，植入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)，12周、24周后取修復(fù)組織塊行HE染色，堿性甲苯胺藍(lán)染色，Ⅰ型、Ⅱ型膠原與S100蛋白的免疫化學(xué)組織染色，探討以此修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損結(jié)構(gòu)和功能的可行性。
　　 結(jié)果：在體外培養(yǎng)條件下兔SMSCs的增生分裂能

4、力十分活躍，可以通過離體培養(yǎng)使其實(shí)現(xiàn)數(shù)目的擴(kuò)增；DNA含量檢測、染色體核型分析、荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SMSCs是正常的二倍體細(xì)胞，無致瘤性，可作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中作為支架的PLGA經(jīng)組織切片和掃描電鏡的觀察表明是一種織網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)，其表面及內(nèi)部均含有豐富的微孔結(jié)構(gòu)，分子量100000，平均孔徑200-300um，孔隙率90％，厚2mm，與軟骨細(xì)胞及SMCSs有良好的組織相容性，可作為SMCSs的支架材料。在體外，SMSCs-P

5、LGA復(fù)合體在生物培養(yǎng)器中經(jīng)BMP-2、TGF-β3和DEX協(xié)同誘導(dǎo)28天后，RT-PCR檢測到Ⅰ型、Ⅱ型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色也證實(shí)有Ⅰ型、Ⅱ型膠原的表達(dá)，同時(shí)堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色也證實(shí)有軟骨細(xì)胞特異性胞外基質(zhì)軟骨特異性糖胺聚糖(GAG)成分，以上即證明SMSCs已進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系；SMSCs-PLGA復(fù)合物植入股骨髁軟骨缺損區(qū)24周后大體觀察原軟骨缺損區(qū)有透明軟骨

6、樣組織生成，HE染色可見透明軟骨樣結(jié)構(gòu)，周圍膠原纖維結(jié)構(gòu)明顯，排列規(guī)則；堿性甲苯胺藍(lán)染色可見藍(lán)色異染基質(zhì)-GAG；Ⅱ型膠原與S100蛋白的免疫化學(xué)組織染色呈強(qiáng)陽性，未檢測到Ⅰ型膠原。支架組和空白組分別僅發(fā)現(xiàn)纖維樣組織和纖維軟骨。
　　 結(jié)論：利用兔異體SMSCs經(jīng)體外培養(yǎng)傳代后，加入纖維蛋白后按一定的密度放入成型的聚乳酸乙醇酸共聚物支架，種子細(xì)胞支架復(fù)合體在添加有細(xì)胞因子的生物培養(yǎng)器中擴(kuò)增28天，回植入關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)的方法，是一