脂肪干細胞復合牛心包膜修復兔腹壁缺損的實驗研究.pdf

1、【背景和目的】
　　近年來，組織工程技術在女性盆底重建外科學的研究中得到了越來越多的應用，是女性盆底重建外科學的一個重要的發(fā)展領域。本論文針對目前盆底重建手術面臨的一些侵蝕（erosion）、性交痛(dyspareunia)、暴露(exposure)、收縮(shrinkage)、瘺管（fistula）等術后并發(fā)癥問題，構建一種脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）復合脫細胞牛心包膜（acel

2、lular bovine pericardium，ABP）的新型網(wǎng)片，并將其用于修復兔腹壁缺損模型，探索組織工程技術在女性盆底重建中的應用，為女性盆底重建的研究提供新思路。
　　【方法】
　　1、兔ADSCs的分離培養(yǎng)、鑒定及標記：
　?。?）使用酶消化法、差速貼壁法取兔腹股溝區(qū)脂肪組織體外分離培養(yǎng)兔脂肪干細胞，每日在顯微鏡下觀察記錄其增殖特征及形態(tài)特點；
　?。?）流式細胞儀鑒定第3代脂肪干細胞的表面標記物并分

3、別行成脂、成骨誘導分化，證明其多向分化能力；
　?。?）取第3代脂肪干細胞，以慢病毒介導的綠色熒光蛋白（pGC FU-EGFP-Lentivirus）轉染，轉染后48小時倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達情況；
　?。?）取經pGC FU-EGFP-Lentivirus標記的第5代脂肪干細胞，利用流式細胞技術檢測pGC FU-EGFP-Lentivirus的轉染率。
　　2、交聯(lián)ABP的制備：交聯(lián)ABP由上海欣吉特生物科

4、技有限公司提供。行HE染色觀察其脫細胞效果及組織結構。
　　3、組織工程生物活性補片的構建：
　?。?）將經pGC FU-EGFP-Lentivirus標記的第5代兔ADSCs接種于脫細胞牛心包膜上，熒光顯微鏡觀察細胞的生長情況；
　　（2） MTT法檢測脂肪干細胞在脫細胞牛心包膜上的增殖情況。
　　4、兔腹壁缺損模型的建立及補片性能的評估：
　?。?）于12只成年雌性新西蘭大白兔腹壁制作腹壁缺損模型，根據(jù)

5、不同的處理方式分為以下4組：實驗組（將復合兔ADSCs的交聯(lián)ABP植入兔腹壁缺損處）；交聯(lián)ABP植入+干細胞注射組（將交聯(lián)ABP植入兔腹壁缺損處后ABP下注射干細胞）；交聯(lián)ABP植入組（單純交聯(lián)ABP植入）；空白對照組（腹壁缺損處不作任何處理）；
　?。?）分別于移植后第1、2、3月取出移植物行組織學觀察評價宿主的炎癥反應及兔ADSCs復合交聯(lián)ABP的生物相容性；行熒光顯微鏡觀察兔腹壁缺損處綠色熒光蛋白的表達情況；行拉力試驗研究生

6、物活性補片植入后的生物力學性能。
　　【結果】
　　1、傳代培養(yǎng)的兔ADSCs形態(tài)較為均勻，呈旋渦狀、輻射狀排列，體外增殖穩(wěn)定快速。流式細胞儀檢測示CD29、CD90、CD105表達陽性，CD34表達陰性，油紅O及茜素紅染色均為陽性。
　　2、HE染色顯示牛心包膜的細胞基本脫去，呈由染成紅色的膠原纖維組成網(wǎng)格狀結構。
　　3、pGC FU-EGFP-Lentiviru轉染兔ADSCs48小時后，熒光顯微鏡可觀察到

7、EGFP高表達。流式細胞儀檢測示pGC FU-EGFP-Lentivirus的轉染率達78%左右。此外，熒光顯微鏡觀察示ADSCs在ABP上黏附生長良好，MTT示細胞增殖能力與未接種于脫細胞牛心包膜的ADSCs無明顯區(qū)別。
　　4、所有動物均未發(fā)生補片侵蝕。實驗組和交聯(lián)ABP+干細胞注射組移植后各個時間點的移植物皺縮及粘連均顯著小于單純交聯(lián)ABP植入組。熒光顯微鏡觀察示植入后的各個時間點實驗組和交聯(lián)ABP+干細胞注射組均可觀察到E

8、GFP表達，EGFP的表達量未見明顯差別，且隨著時間的推移EGFP的表達量均未見明顯減弱。組織學觀察示實驗組和交聯(lián)ABP+干細胞注射組的生物相容性均優(yōu)于單純交聯(lián)ABP植入組，而實驗組與交聯(lián)ABP+干細胞注射組之間無明顯差別。
　　5、拉力試驗發(fā)現(xiàn)植入后各個時間點含有交聯(lián)ABP的各個組的斷裂拉伸應力參數(shù)均高于空白組，而實驗組及交聯(lián)ABP+干細胞注射組的斷裂拉伸應力參數(shù)則高于單純交聯(lián)ABP植入組。隨植入時間的延長，各個組的斷裂拉伸應力