非誘導脂肪干細胞膜片復合PRF修復兔髁狀突軟骨缺損.pdf

1、背景:
　　顳下頜關節(jié)(te mpo ro ma nd ib ula r jo int，TMJ)是人體比較重要且復雜的關節(jié)，下頜髁突軟骨常常因外傷、炎癥、骨關節(jié)病等引起損傷。由于關節(jié)軟骨沒有血管組織，所以自身對于缺損的修復能力較弱,常無法自行修復并導致進一步破壞。嚴重者造成關節(jié)功能喪失，對病人的生活造成極大障礙。目前，雖有多種方法用于修復軟骨缺損，但這些修復的方法都存在很多的局限性。探索一種有效的軟骨修復方法就成為了一種迫切的需求

2、。組織工程技術的出現(xiàn)，使越來越多的人通過組織工程的方法來修復軟骨缺損。前期課題組通過未分化的脂肪間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）復合富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）修復兔耳軟骨取得了較好的效果。故本實驗設想探討一下未分化的ADSCs復合PRF在體內修復活動性的髁狀突軟骨缺失是否具有可行性。
　　目的:
　　探索非誘導ADSCs膜片復合 PRF

3、植入兔下頜骨髁狀突軟骨缺損處觀察其修復效果。為治療髁狀突軟骨缺損找到新方法，為臨床病人解決難題。
　　方法:
　　1、從家兔背部獲取脂肪組織，胰蛋白酶消化后離心獲得ADSCs。然后通過細胞的生長表型，成骨與成脂能力的測定，細胞表面相應抗原的檢測。來證明獲得的細胞就是脂肪間充質干細胞。證明后通過加入抗壞血酸將細胞誘導培養(yǎng)成細胞膜片，為下一步的實驗奠定基礎。
　　2、從家兔耳緣中動脈采集血液，高速離心后獲得PRF膠體，凍干

4、制成粉劑備用。
　　3、建立實驗的動物模型。通過手術的方法暴露家兔髁狀突關節(jié)面，使用裂鉆制造一直徑3mm、深度3mm累積軟骨下骨的缺損。
　　4、將36只雄性新西蘭大白兔隨機分為3組：空白組、PRF組、ADSCs膜片復合PRF組，每組12只。都按建立動物模型的方法制造軟骨缺損。缺損建立后，空白組不植入任何東西；PRF組植入PRF材料；ADSCs膜片復合PRF組植入異體ADSCs膜片與PRF的復合物。術后1月、2月、3月取材，

5、通過標本大體觀察及組織學染色的結果來確定軟骨缺損的修復情況。
　　5、采集每一只實驗動物術前及術后7d、14d、30d的血液，檢測其中的CD4、CD8、IL-2、IL-4的水平來檢測異體ADSCs移植是否產生了免疫排斥反應。
　　6、統(tǒng)計學方法。數據通過SPSS17進行分析，數據以均數±標準差（X±SD）表示，多樣本均數比較采用方差分析，兩樣本均數的比較采用SNK-q法，檢驗水準α值取雙側0.05。
　　結果:

6、　　1、分離的ADSCs在培養(yǎng)皿里呈集落樣漩渦狀生長，HE染色中核藍染、胞漿紅染。ADSCs體外成功的誘導成了脂肪細胞和骨細胞，表面抗原的流式檢測結果為CD29、CD44為高表達，CD31、CD34、CD45低表達。這些都復合ADSCs的特點。
　　2、在空白組髁狀突缺損模型建立后的1月、2月、3月各時間點的標本進行肉眼觀及組織學染色分析，其結果都表面人為造成的軟骨缺損處幾乎沒有修復軟骨組織的形成，這說明了實驗模型的建立是成功的。

7、
　　3、移植后的修復情況。肉眼觀與組織學染色的結果都顯示：空白組在術后的各個時間點軟骨缺損區(qū)都沒有修復的軟骨組織形成，隨著時間的延長缺損底部有新生的骨組織。同時有少量的軟骨細胞向新生的骨表面爬行。在PRF組中，術后未見明顯的新生軟骨組織，缺損兩端僅見少部分正常軟骨爬行形成的軟骨組織缺損明顯。而在ADSCs膜片復合PRF組中在第一個月時見缺損底部有一薄層白色軟骨組織形成，在組織學染色中其細胞排列不如正常軟骨規(guī)則色稍淡。在術后2月時

8、新生的軟骨組織就已基本填滿缺損，有的地方在與正常組織交接的地方還有微小的間隙。術后3月時肉眼下新生組織表面光滑且固有組織的交接處變得更模糊，需仔細辨認方能發(fā)現(xiàn)，組織學切片中修復的軟骨組織更為緊湊單位體積內軟骨細胞的密度更大，新生軟骨組織與骨組織交接的地方出現(xiàn)了部分纖維化和骨化。Image pro-P lus6.0分析得出，缺損修復術后3月，空白組修復率是（1.32±0.23）％，PRF組是（10.37±0.76）%、ADSCs膜片復合

9、PRF組是（87.25±4.12）%，進行兩兩比較方差分析，各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。就可以得出這樣的結論：PRF有促進軟骨組織形成的作用，但在這種極限缺損范圍內的缺損光有PRF還是不夠的還需要種子細胞；實驗組較好的修復效果說明了未分化ADSCs膜片復合PRF修復髁狀突這種功能性軟骨缺損是可行的。
　　4、各實驗組的動物在術前與術后7d、14d、30d測量的CD4和CD8細胞、IL-2、IL-4因子的水平以及計

10、算出來的CD4/CD8值，經完全隨機設計方差分析得出各實驗組在組內及組間均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在高倍鏡下觀察HE切片未發(fā)現(xiàn)免疫細胞浸潤。這就說明異體ADSCs未使機體產生排異反應。
　　結論:
　　1、從脂肪組織中獲得的細胞就是ADSCs，體外分裂能力強。培養(yǎng)過程簡單。只需加入一定量的抗壞血酸就能將其誘導培養(yǎng)成細胞膜片，這樣細胞的數量成倍的增多，胞外基質和細胞形成了一三維立體網狀結構細胞穩(wěn)定性好不易流失。適合組織缺