ADSCs復(fù)合PRF修復(fù)家兔耳軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【背景】
　　根據(jù)國家疾控中心的不完全統(tǒng)計(jì),因疾病和外傷導(dǎo)致的軟骨缺損發(fā)生率約為1.5％-3%,隨著運(yùn)動意識的提高,以及交通等意外事故的增加,其發(fā)生率逐年遞增。雖然目前也有許多治療軟骨缺損的方法,如自體軟骨移植、異體軟骨移植以及人工合成生物材料等,但總是不太理想,要么取材不便,要么不易操作,并且花費(fèi)太大。組織工程為軟骨損傷修復(fù)提供了新的選擇,操作方便、安全有效、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的軟骨缺損修復(fù)方法正在被廣泛研究與探索。本課題就是以方便、安全

2、、有效、經(jīng)濟(jì)為宗旨,嘗試將未誘導(dǎo)的自體或異體ADSCs與PRF復(fù)合作為一種軟骨修復(fù)材料,研究其對家兔耳軟骨全層缺損的修復(fù)作用,為以后組織工程軟骨的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。
　　【目的】
　　將未誘導(dǎo)的自體或異體脂肪干細(xì)胞(ADSCs)與富血小板纖維蛋白(PRF)復(fù)合,作為一種全新的軟骨修復(fù)材料,探討其對家兔耳軟骨全層缺損修復(fù)的可行性,并檢測其免疫排斥反應(yīng)。
　　【方法】
　　1、采用組織分離培養(yǎng)法從家兔背部脂肪中獲取

3、ADSCs進(jìn)行培養(yǎng),將獲得的細(xì)胞進(jìn)行HE染色、成脂肪及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),并使用FCM對干細(xì)胞分子表型進(jìn)行鑒定,最后將目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行大量的體外培養(yǎng),供移植使用。
　　2、制備家兔PRF,并與培養(yǎng)的ADSCs復(fù)合作為一種軟骨缺損修復(fù)材料備用。
　　3、建立軟骨缺損動物模型。在家兔耳廓做出一個(gè)軟骨全層缺損的創(chuàng)傷,使用ADSCs與PRF復(fù)合物移植修復(fù),通過大體觀察與組織學(xué)觀察(HE和阿爾新蘭染色)的方法觀察軟骨缺損的修復(fù)情況。
　　

4、4、實(shí)驗(yàn)分組。取家兔30只,于每只家兔耳部做4處軟骨全層缺損,隨機(jī)分為6組,A組,作為空白對照;B組植入自體ADSCs;C組植入異體ADSCs;D組植入自體PRF;E組植入自體ADSCs與PRF的復(fù)合物;F組植入異體ADSCs與PRF的復(fù)合物。分別于術(shù)后1月、2月、3月取材,進(jìn)行大體、HE染色及阿爾新蘭染色觀察,并使用IPP6.0軟件對軟骨生成量進(jìn)行半定量分析。
　　5、免疫學(xué)檢測。分別取實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后1w、2w、4w、3月的家兔

5、全血和血漿,流式細(xì)胞儀進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞CD4和CD8亞群的檢測,ELISA法測定血漿中IL-2和IL-4的水平。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)形式表示,多個(gè)樣本均數(shù)比較用方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0.05.
　　【結(jié)果】
　　1、該實(shí)驗(yàn)分離獲取培養(yǎng)的ADSCs形態(tài)呈現(xiàn)為長梭形,自我更新和增殖能力強(qiáng),表達(dá)脂肪干細(xì)胞特異

6、性的表面抗原CD29,其陽性表達(dá)率為(91.2±2.9)%,而CD31陰性表達(dá),表達(dá)率為(2.9±1.5)%,且可向成脂和成骨的方向分化,其生物學(xué)特性穩(wěn)定。
　　2、制備的PRF形態(tài)良好,質(zhì)地韌,有彈性,易于進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)。
　　3、動物模型成功建立。大體觀察,HE和阿爾新蘭染色均顯示,模型建立3個(gè)月后軟骨缺損區(qū)無新生軟骨形成,表明軟骨缺損動物模型成功建立。
　　4、移植后效果觀察結(jié)果。大體及組織學(xué)觀察顯示,3月后,A組

7、無新生軟骨生成,軟骨缺損無修復(fù)跡象;B組和C組在缺損區(qū)邊緣均可見到少量的新生軟骨組織,但缺損區(qū)仍很明顯,與空白對照組相似;D組,大體觀察見缺損區(qū)有一層膜狀物形成,組織學(xué)觀察見新生軟骨組織較多,對缺損有一定的修復(fù)作用;E組和F組,可見缺損區(qū)被新生軟骨組織覆蓋,表面光滑,與周圍軟骨組織融合一致,修復(fù)效果最佳。IPP6.0統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,移植物植入3月后,A組軟骨缺損修復(fù)率為(1.68±0.17)%,B組為(15.9±0.87)%、C組為(15

8、.4±0.91.)%,D組為(32.0±2.76)%,E組為(87.59±3.21)%、F組為(85.77±4.88)%。SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,B組與C組之間(P>0.05)、E組與F組之間(P>0.05),組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可以認(rèn)為自體ADSCs組與異體ADSCs組兩組之間的修復(fù)效果無差異,自體ADSCs復(fù)合PRF組與異體ADSCs復(fù)合PRF組兩組之間的修復(fù)效果無差異;空白對照組、ADSCs組、PRF組、ADSCs復(fù)合PRF組

9、,各組間(P<0.01),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明四組間修復(fù)效果均存在顯著性差異。
　　5、免疫學(xué)檢測結(jié)果顯示,異體ADSCs參與的組織修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)動物在修復(fù)材料植入前與植入后測得的淋巴細(xì)胞CD4和CD8亞群、CD4/CD8比值和IL-2、IL-4的值,在不同時(shí)間點(diǎn)所測值的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);HE染色結(jié)果同樣顯示:異體ADSCs植入?yún)^(qū)的組織中并無淋巴細(xì)胞浸潤,均表明異體ADSCs的植入沒有引起明顯的免疫排斥反應(yīng)。