BMSC與FG復(fù)合修復(fù)陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 (1)在兔股骨髁關(guān)節(jié)面制造關(guān)節(jié)軟骨缺損的動(dòng)物模型，研究不同時(shí)間、缺損大小對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨的影響陳舊性纖維化情況，為制備陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型及后期修復(fù)實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)；(2)應(yīng)用可注射型纖維蛋白膠(FG)負(fù)載體外培養(yǎng)的自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)以組織工程方法構(gòu)建可注射型組織工程軟骨缺損修復(fù)植入物，觀察種子細(xì)胞在材料中的生長(zhǎng)情況，了解兩者的相融性；(3)以動(dòng)物自體BMSC復(fù)合FG構(gòu)建的修復(fù)材料，分別對(duì)陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損模

2、型和新鮮關(guān)節(jié)軟骨缺損模型進(jìn)行修復(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以比較兩組模型的修復(fù)效果。通過陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損與新鮮關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型的修復(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，為臨床上對(duì)于陳舊性軟骨缺損病的修復(fù)方法提供新的思路。 方法 1、兔陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損的動(dòng)物模型制備：健康6周齡新西蘭大白兔，雌雄不限，平均體重1.5～2.0kg。用3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)行靜脈麻醉后，無菌操作下行膝內(nèi)側(cè)切口，逐層切開達(dá)關(guān)節(jié)腔，將髕骨導(dǎo)向外側(cè)脫位，顯露股骨髁關(guān)節(jié)面，用

3、牙科鉆打圓形孔，每孔直徑4mm，深度約3mm，達(dá)軟骨下骨，術(shù)畢，復(fù)回髕骨，逐層關(guān)閉傷口，下肢固定，籠中自由喂養(yǎng)。術(shù)后分別在6、12周觀察動(dòng)物的關(guān)節(jié)活動(dòng)度，并于術(shù)后取出關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)切片觀察。 2、兔BMSC的分離、培養(yǎng)及BMSC與FG混合植入物的制備：抽取新西蘭兔髂骨骨髓，體外以全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)、擴(kuò)增BMSC。以體外培養(yǎng)的BMSC與FG構(gòu)建可注射型混合植入物，調(diào)整細(xì)胞終濃度約為5×106/ml。倒置顯微鏡

4、觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖變化情況，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞與材料的附著情況。 3、BMSC與FG復(fù)合修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損分組對(duì)照實(shí)驗(yàn)：36只兔共72側(cè)膝關(guān)節(jié)，隨機(jī)分3組、Ⅰ組(空白對(duì)照組)、12側(cè)膝關(guān)節(jié)，鉆孔后不植入任何材料作空白對(duì)照；Ⅱ組(新鮮修復(fù)組)、30側(cè)膝關(guān)節(jié)，鉆孔后立即植入BMSC與FG混合物；Ⅲ組(陳舊修復(fù)組)、30側(cè)膝關(guān)節(jié)，鉆孔12周后植入BMSC與FG混合物。在混合物植入前，應(yīng)充分剔除軟骨缺損空洞內(nèi)增

5、生的肉芽組織，以暴露出新鮮的軟骨為宜。30只實(shí)驗(yàn)組兔子，每只兔子兩側(cè)膝關(guān)節(jié)分別行Ⅱ組、Ⅲ組缺損修復(fù)術(shù)；6只空白對(duì)照組兔子，每只兔子兩側(cè)膝關(guān)節(jié)分別為未修復(fù)。術(shù)后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行大體觀察、了解兔膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)度；并于術(shù)后第4、12和24周取出骨缺損區(qū)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)切片觀察，參照Pineda設(shè)計(jì)的關(guān)節(jié)軟骨半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)組織切片評(píng)分。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)處理，采用析因設(shè)計(jì)資料方差分析、單方向方差分析(One-wayANOVA)和配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析，P＜0.05，差異有顯著性意義。 結(jié)果 1、12周組兔關(guān)節(jié)軟骨及周圍組織炎癥反應(yīng)較6周組輕，纖維瘢痕化較6周組明顯，較接近陳舊性損傷模型。12周組兔膝關(guān)節(jié)周圍軟組織出現(xiàn)增生性改變，尤其是關(guān)節(jié)周圍的肌腱、關(guān)節(jié)囊、韌帶、滑囊等結(jié)締組織較6周組更容易形成瘢痕、粘連、纖維化等陳舊性損傷組織學(xué)改變。缺損面積大于直徑4mm，深度約3m

7、m，達(dá)軟骨下骨時(shí)缺損處在12周后可見自行修復(fù)不完全，缺損明顯。 2、倒置顯微鏡觀察BMSC可較好貼附于FG支架材料中，材料中細(xì)胞密度均勻，細(xì)胞形態(tài)呈多形性；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)FG支架材料組細(xì)胞生長(zhǎng)呈顯著性增長(zhǎng)趨勢(shì)，與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)G支架材料組細(xì)胞增長(zhǎng)更明顯。FG支架材料組與空白對(duì)照對(duì)照組之間采用配對(duì)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.035，P=0.000)。 3、Pineda評(píng)分在細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)異染

8、、表面平整度、軟骨厚度和結(jié)合度五方面的測(cè)定受不同測(cè)量時(shí)間與分組的影響，采用析因設(shè)計(jì)方差分析存在交互效應(yīng)；又固定效應(yīng)做單因子方差分析后，用LSD進(jìn)行兩兩比較，其中不同處理時(shí)間對(duì)上述幾方面評(píng)分具有顯著性影響。特別是第4周時(shí)新鮮修復(fù)組較陳舊修復(fù)組在表面平整度和結(jié)合度兩方面評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。24周時(shí)可見空白對(duì)照組中大多為纖維組織，無透明軟骨，見少量纖維軟骨。在細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)異染、表面平整度和新生軟骨厚度幾方面評(píng)分均明顯差于新鮮修

9、復(fù)組和空白對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論 (1)兔后膝股骨髁關(guān)節(jié)面軟骨缺損直徑4mm，深度約3mm，達(dá)軟骨下骨的模型，利用后膝伸直位制動(dòng)12周的方法來復(fù)制出膝陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損模型較接近于臨床基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究；(2)以可注射型FG為支架材料，復(fù)合體外培養(yǎng)的BMSC構(gòu)建可注射型組織工程軟骨是一種切實(shí)可行的方法。FG支架材料對(duì)細(xì)胞增殖有顯著性促進(jìn)作用，體外培養(yǎng)7d后種子細(xì)胞仍保持高增殖特性，且具有細(xì)胞負(fù)載率高，復(fù)合

10、種子細(xì)胞操作簡(jiǎn)單，組織相容性好，易于降解，無毒性，進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)具有創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)單、可塑性強(qiáng)，使缺損區(qū)充分接觸修復(fù)材料，大大增加了新生軟骨與周圍軟骨的整合率的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景；(3)新鮮關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)組早期在修復(fù)平整度和結(jié)合度方面優(yōu)于陳舊關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)組，但在后期兩組中新生軟骨組織塑形、表面平整、分界不清，已基本與正常軟骨結(jié)構(gòu)相近。提示了臨床上修復(fù)陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損在創(chuàng)面處理上應(yīng)造成一個(gè)類似于新鮮關(guān)節(jié)軟骨缺損的創(chuàng)