BMSC與FG復合修復陳舊性關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的 (1)在兔股骨髁關節(jié)面制造關節(jié)軟骨缺損的動物模型，研究不同時間、缺損大小對兔關節(jié)軟骨的影響陳舊性纖維化情況，為制備陳舊性關節(jié)軟骨缺損動物模型及后期修復實驗提供研究基礎；(2)應用可注射型纖維蛋白膠(FG)負載體外培養(yǎng)的自體骨髓基質(zhì)干細胞(BMSC)以組織工程方法構建可注射型組織工程軟骨缺損修復植入物，觀察種子細胞在材料中的生長情況，了解兩者的相融性；(3)以動物自體BMSC復合FG構建的修復材料，分別對陳舊性關節(jié)軟骨缺損模

2、型和新鮮關節(jié)軟骨缺損模型進行修復對照實驗，以比較兩組模型的修復效果。通過陳舊性關節(jié)軟骨缺損與新鮮關節(jié)軟骨缺損動物模型的修復對照實驗，為臨床上對于陳舊性軟骨缺損病的修復方法提供新的思路。 方法 1、兔陳舊性關節(jié)軟骨缺損的動物模型制備：健康6周齡新西蘭大白兔，雌雄不限，平均體重1.5～2.0kg。用3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)行靜脈麻醉后，無菌操作下行膝內(nèi)側(cè)切口，逐層切開達關節(jié)腔，將髕骨導向外側(cè)脫位，顯露股骨髁關節(jié)面，用

3、牙科鉆打圓形孔，每孔直徑4mm，深度約3mm，達軟骨下骨，術畢，復回髕骨，逐層關閉傷口，下肢固定，籠中自由喂養(yǎng)。術后分別在6、12周觀察動物的關節(jié)活動度，并于術后取出關節(jié)軟骨缺損區(qū)標本進行大體觀察和組織學切片觀察。 2、兔BMSC的分離、培養(yǎng)及BMSC與FG混合植入物的制備：抽取新西蘭兔髂骨骨髓，體外以全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)、擴增BMSC。以體外培養(yǎng)的BMSC與FG構建可注射型混合植入物，調(diào)整細胞終濃度約為5×106/ml。倒置顯微鏡

4、觀察細胞生長情況，以MTT法檢測各組細胞增殖變化情況，觀察細胞生長及細胞與材料的附著情況。 3、BMSC與FG復合修復兔關節(jié)軟骨缺損分組對照實驗：36只兔共72側(cè)膝關節(jié)，隨機分3組、Ⅰ組(空白對照組)、12側(cè)膝關節(jié)，鉆孔后不植入任何材料作空白對照；Ⅱ組(新鮮修復組)、30側(cè)膝關節(jié)，鉆孔后立即植入BMSC與FG混合物；Ⅲ組(陳舊修復組)、30側(cè)膝關節(jié)，鉆孔12周后植入BMSC與FG混合物。在混合物植入前，應充分剔除軟骨缺損空洞內(nèi)增

5、生的肉芽組織，以暴露出新鮮的軟骨為宜。30只實驗組兔子，每只兔子兩側(cè)膝關節(jié)分別行Ⅱ組、Ⅲ組缺損修復術；6只空白對照組兔子，每只兔子兩側(cè)膝關節(jié)分別為未修復。術后對動物進行大體觀察、了解兔膝關節(jié)的活動度；并于術后第4、12和24周取出骨缺損區(qū)標本進行大體觀察和組織學切片觀察，參照Pineda設計的關節(jié)軟骨半定量評分標準對組織切片評分。 4、統(tǒng)計學處理方法：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)

6、計學處理，采用析因設計資料方差分析、單方向方差分析(One-wayANOVA)和配對樣本t檢驗分析，P＜0.05，差異有顯著性意義。 結(jié)果 1、12周組兔關節(jié)軟骨及周圍組織炎癥反應較6周組輕，纖維瘢痕化較6周組明顯，較接近陳舊性損傷模型。12周組兔膝關節(jié)周圍軟組織出現(xiàn)增生性改變，尤其是關節(jié)周圍的肌腱、關節(jié)囊、韌帶、滑囊等結(jié)締組織較6周組更容易形成瘢痕、粘連、纖維化等陳舊性損傷組織學改變。缺損面積大于直徑4mm，深度約3m

7、m，達軟骨下骨時缺損處在12周后可見自行修復不完全，缺損明顯。 2、倒置顯微鏡觀察BMSC可較好貼附于FG支架材料中，材料中細胞密度均勻，細胞形態(tài)呈多形性；MTT實驗結(jié)果顯示隨培養(yǎng)時間的延長FG支架材料組細胞生長呈顯著性增長趨勢，與空白對照組相比，F(xiàn)G支架材料組細胞增長更明顯。FG支架材料組與空白對照對照組之間采用配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(t=26.035，P=0.000)。 3、Pineda評分在細胞形態(tài)、基質(zhì)異染

8、、表面平整度、軟骨厚度和結(jié)合度五方面的測定受不同測量時間與分組的影響，采用析因設計方差分析存在交互效應；又固定效應做單因子方差分析后，用LSD進行兩兩比較，其中不同處理時間對上述幾方面評分具有顯著性影響。特別是第4周時新鮮修復組較陳舊修復組在表面平整度和結(jié)合度兩方面評分有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。24周時可見空白對照組中大多為纖維組織，無透明軟骨，見少量纖維軟骨。在細胞形態(tài)、基質(zhì)異染、表面平整度和新生軟骨厚度幾方面評分均明顯差于新鮮修

9、復組和空白對照組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結(jié)論 (1)兔后膝股骨髁關節(jié)面軟骨缺損直徑4mm，深度約3mm，達軟骨下骨的模型，利用后膝伸直位制動12周的方法來復制出膝陳舊性關節(jié)軟骨缺損模型較接近于臨床基礎實驗研究；(2)以可注射型FG為支架材料，復合體外培養(yǎng)的BMSC構建可注射型組織工程軟骨是一種切實可行的方法。FG支架材料對細胞增殖有顯著性促進作用，體外培養(yǎng)7d后種子細胞仍保持高增殖特性，且具有細胞負載率高，復合

10、種子細胞操作簡單，組織相容性好，易于降解，無毒性，進行關節(jié)軟骨缺損修復具有創(chuàng)傷小、操作簡單、可塑性強，使缺損區(qū)充分接觸修復材料，大大增加了新生軟骨與周圍軟骨的整合率的優(yōu)點，具有廣闊的臨床應用前景；(3)新鮮關節(jié)軟骨缺損修復組早期在修復平整度和結(jié)合度方面優(yōu)于陳舊關節(jié)軟骨缺損修復組，但在后期兩組中新生軟骨組織塑形、表面平整、分界不清，已基本與正常軟骨結(jié)構相近。提示了臨床上修復陳舊性關節(jié)軟骨缺損在創(chuàng)面處理上應造成一個類似于新鮮關節(jié)軟骨缺損的創(chuàng)