膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷是臨床上造成關(guān)節(jié)軟骨損傷的常見原因，隨著現(xiàn)代社會人口老齡化及經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)生明顯增加，損傷后的自身修復(fù)能力低下，常引起嚴(yán)重的關(guān)節(jié)功能障礙。目前臨床有多種治療方法，但效果均不能令人滿意，組織工程軟骨的發(fā)展為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)帶來了光明前景。但新生軟骨與關(guān)節(jié)下骨及與周圍軟骨的結(jié)合問題有待解決。 本實驗擬對新型雙向三維支架材料膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣在體外與軟骨細(xì)胞的相容性和吸附性進(jìn)行研究，評價其作為軟骨組織

2、工程支架的可行性。并用新型雙向三維可降解生物活性材料--膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣對動物關(guān)節(jié)軟骨損傷缺損進(jìn)行修復(fù)，以促使其軟骨自身再生，以期獲得高質(zhì)量、穩(wěn)定結(jié)合的關(guān)節(jié)軟骨。 材料與方法： 1.實驗主要試劑 A.特殊組化染色試劑：甲苯胺藍(lán) B.免疫組化試劑： CollagenlIAb單克隆抗體SABC試劑盒：即用型DAB顯色試劑盒 C.細(xì)胞分離及培養(yǎng)試劑： Dulbecco改良DMEM/H

3、amF12混合培養(yǎng)基胎牛血清II型膠原酶鏈球菌蛋白酶 2.材料 (1).動物來源： 6～8周齡新西蘭大白兔，體重2～2.5kg，雌雄不限，購于嶺南試驗動物中心。 (2).膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣支架材料： 支架材料由華南理工大學(xué)生物材料研究所研制提供，I型膠原為基材，與具有良好生物活性的磷酸三鈣粉體共混交聯(lián)，經(jīng)冷凍干燥成型。其中膠原為支架主體，材料上面1mm為純膠原，以下磷酸三鈣粉體呈梯度分布，濃度由

4、下而上遞減。將制備好的柱狀膠原磷酸三鈣復(fù)合材料冷凍干燥后，經(jīng)環(huán)氧乙烷氣體消毒后備用。 3.實驗方法 (1)軟骨細(xì)胞的提取及培養(yǎng) 大白兔空氣栓塞處死后。在無菌條件下用手術(shù)刀取出雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，切成約1mm3的碎片。用酶消化法提取兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/HamF12進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并行倒置顯微鏡觀察。 (2)軟骨細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng) 將膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣支架材料修剪成直徑4m

5、m、厚1mm圓盤狀，置入6孔培養(yǎng)板，取第3代軟骨細(xì)胞接種于支架材料內(nèi)，進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。 (3)軟骨細(xì)胞與支架材料相容性觀察 培養(yǎng)3，7d后，分別取出復(fù)合細(xì)胞的支架材料常規(guī)行HE染色，II型膠原免疫組織化學(xué)染色。 (4)掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的黏附狀態(tài) 復(fù)合細(xì)胞的支架培養(yǎng)3，7d后以2.5％的戊二醛固定，梯度酒精脫水，叔丁醇置換，真空干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料表面及內(nèi)部的黏附形態(tài)。

6、 (5)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)軟骨缺損動物模型制備 魯米那靜脈麻醉實驗動物，取膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口，暴露股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面，在其股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面用電鉆鉆出直徑4mm，深3mm的圓柱狀缺損，形成創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)軟骨缺損動物模型。 (6)Co/TCP復(fù)合材料修復(fù)軟骨的動物實驗 30只大白兔雙膝人為形成關(guān)節(jié)軟骨缺損，選擇右膝為實驗組，嵌入大小、形狀與缺損相似的Col/TCP；左側(cè)為對照組，缺損不予處理，縫合關(guān)節(jié)囊和皮膚。術(shù)后膝關(guān)節(jié)不固定，置籠

7、內(nèi)自由活動。于術(shù)后4、6、8、12和24周空氣栓塞法各處死6只分別取材。 (7)再生軟骨組織的檢測 1)大體觀察術(shù)后觀察動物活動、步態(tài)、傷口愈合及缺損修復(fù)情況、膝關(guān)節(jié)有無攣縮、粘連和新生物、修復(fù)組織的平整性、光澤度及與周圍組織的結(jié)合情況。 2)組織學(xué)觀察取雙膝股骨外髁標(biāo)本，4％多聚甲醛固定，EDTA脫鈣，常規(guī)石蠟包埋切片，甲苯胺藍(lán)染色和HE染色行組織學(xué)觀察，并采用盲法對各標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)采用Wakit

8、anifa法。 3)II型膠原免疫組織化學(xué)染色常規(guī)石蠟切片，按免疫組織化學(xué)試劑盒說明進(jìn)行操作，DAB顯色。通過Photoshop7.0計算圖像平均像素密度，取每張切片修復(fù)組織與正常關(guān)節(jié)軟骨像素強(qiáng)度比值作為統(tǒng)計指標(biāo)。行統(tǒng)計學(xué)分析。 4)透射電鏡觀察實驗組和對照組取缺損區(qū)表層新生組織，2.5％戊二醛及1％OsO4雙固定，常規(guī)脫水包埋切片、鉛鈾雙染，在透射電鏡下觀察。 結(jié)果： 1.材料的形態(tài)和孔隙率 掃

9、描電鏡可以觀察到支架材料具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔隙結(jié)構(gòu)規(guī)則，孔徑約100～150μm，材料內(nèi)部孔與孔之間貫通良好通過排水法測定材料的孔隙率大于90％。 2.倒置相差顯微鏡觀察 倒置顯微鏡觀察：原代軟骨細(xì)胞，懸浮于培養(yǎng)液中，呈球形。4d后細(xì)胞貼附著尼龍紗巾生長，形狀不一；還可見細(xì)胞貼壁生長，呈多邊形，可見細(xì)胞核分裂相，細(xì)胞增殖極緩慢。經(jīng)1～3代傳代培養(yǎng)，細(xì)胞體積增大突起增多，可見細(xì)胞聚集成簇，有核分裂相的細(xì)胞較少。4或5代細(xì)胞

10、呈去分化表現(xiàn)，細(xì)胞變成長梭形可沿一個方向排列生長，呈纖維細(xì)胞樣，核分裂相仍少見，胞漿中仍有較多顆粒，細(xì)胞匯合、相互接觸時不恢復(fù)原來形態(tài)。 3.軟骨細(xì)胞復(fù)合支架材料組織學(xué)觀察 1)HE染色 支架材料復(fù)合軟骨細(xì)胞培養(yǎng)3天后，孔隙內(nèi)可見大量細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞呈多角形或者不規(guī)則形，少數(shù)呈短梭形，于細(xì)胞周圍間隙可見基質(zhì)成分。支架材料復(fù)合軟骨細(xì)胞培養(yǎng)7天細(xì)胞廣泛分布于支架材料孔隙，呈梭形或圓形，核呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)透亮均勻，細(xì)

11、胞核輪廓清楚。 2)免疫組織化學(xué)染色 支架材料復(fù)合軟骨細(xì)胞培養(yǎng)3天后，材料孔隙中可見大量復(fù)合于支架材料上的細(xì)胞，胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，細(xì)胞周圍出現(xiàn)黃染區(qū)。支架材料復(fù)合軟骨細(xì)胞培養(yǎng)7天胞漿及細(xì)胞周圍棕黃色更加明顯。 4.膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣支架材料與軟骨細(xì)胞相容性的觀察：細(xì)胞基質(zhì)材料體外培養(yǎng)3天后，掃描電鏡觀察見大量細(xì)胞粘附于支架材料上并向深部孔隙長入，已開始分泌出較多膠原纖維，7天后細(xì)胞成團(tuán)狀，互相有纖維連接。

12、 5.膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣支架材料修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨的大體觀察 術(shù)后前3d，所有實驗兔稍跛行，雙膝活動少，隨后活動逐漸增加；2周后行走如常，全部術(shù)膝傷口愈合良好，無感染表現(xiàn)。 實驗組術(shù)后4周缺損區(qū)由白色組織完全充填，表面較光滑，有光澤，與正常軟骨的界線模糊；術(shù)后6周修復(fù)組織完全填平缺損區(qū)，呈白色；術(shù)后8周修復(fù)組織中心部分顏色接近正常軟骨組織，僅見邊緣有小部分組織顏色略深，表面光滑，部分邊界已融合；術(shù)后12周時修復(fù)組織外

13、觀與正常軟骨組織相似，與周圍正常軟骨不容易辨別；術(shù)后24周修復(fù)組織同12周時相似。 對照組術(shù)后4周缺損處有白色纖維組織不完全填充，創(chuàng)面邊緣仍呈紅色；術(shù)后8周缺損處由白色纖維樣組織填充，但表面十分粗糙，與周邊正常組織界線清晰；術(shù)后12周缺損處修復(fù)組織呈白色，可見表面有裂隙；術(shù)后24周缺損處白色修復(fù)組織表面粗糙，與正常組織的界線仍清楚。 6.膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣支架材料修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)觀察 1)HE及甲苯胺藍(lán)染

14、色 實驗組術(shù)后4周，修復(fù)區(qū)見較多幼稚軟骨細(xì)胞，表層細(xì)胞體積較小，數(shù)量稍多，呈水平狀排列，深層細(xì)胞體積較大，排列不規(guī)則，修復(fù)面尚平整，與周圍組織分界清楚，支架材料基本降解吸收；術(shù)后6周及8周，修復(fù)組織中可見明顯增多的軟骨細(xì)胞，與軟骨下骨結(jié)合欠密切，軟骨陷窩多見，細(xì)胞分布不均；術(shù)后12周修復(fù)組織和周圍軟骨整合緊密、厚度相近，其形態(tài)、排列、基質(zhì)染色與正常軟骨相似，可見“潮線”形成，淺層軟骨細(xì)胞胞體較小，與關(guān)節(jié)面平行，深層細(xì)胞排列呈柱狀

15、，與關(guān)節(jié)面垂直，軟骨下骨板基本修復(fù)；術(shù)后24周再生軟骨組織同12周無明顯變化。整個觀察期，實驗組修復(fù)區(qū)組織內(nèi)未見淋巴細(xì)胞浸潤和血管侵入。 對照組術(shù)后4周，缺損區(qū)為纖維組織覆蓋，表面明顯凹陷，可見血管侵入；6～24周，缺損區(qū)仍由纖維組織覆蓋，修復(fù)組織與鄰近組織分界清楚，表面凹陷，修復(fù)組織染色弱而不均勻，可見血管侵入。術(shù)后4、6、8、12、24周實驗組組織學(xué)評分分別為7.60±0.98、5.69±0.58、4.46±0.85、4.3

16、5±0.12、4.41±0.58；對照組分別為10.25±1.05、9.04±0.96、8.96±0.88、8.88±0.68、8.66±0.54，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2)II型膠原免疫組織化學(xué)染色 整個觀察期內(nèi)實驗組新生組織基質(zhì)內(nèi)及軟骨細(xì)胞胞漿內(nèi)均有II型膠原陽性表達(dá)，術(shù)后12周及24周的表達(dá)強(qiáng)于術(shù)后4～8周，同正常軟骨接近；對照組為陰性。 計算平均像素強(qiáng)度行II型膠原半定量分析,同一時間點實驗組與對照

17、組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3)透射電鏡觀察 實驗組4周，可見幼稚軟骨細(xì)胞，細(xì)胞呈同源性集聚；12周，細(xì)胞形態(tài)具備透明軟骨細(xì)胞特征，胞質(zhì)內(nèi)可見多數(shù)擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和小而圓的線粒體；24周，透明軟骨細(xì)胞增多，形態(tài)更加成熟，細(xì)胞表面有短嵴狀突起，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐，網(wǎng)池略擴(kuò)張，并可見糖原顆粒，細(xì)胞周圍有明顯的膠原纖維并形成陷窩。 對照組4周，可見粗大纖維組織，散在纖維細(xì)胞；12周，仍為纖維組織特征；24周，全部為粗大的膠原纖