ADSCs復(fù)合PRF和EPCs治療小鼠放射性涎腺損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景]:臨床上常常因頭頸部的腫瘤切除術(shù)、放療術(shù)等造成涎腺的不可逆性損傷以及自身免疫性疾病等造成涎腺功能減退甚至喪失。涎腺分泌唾液機(jī)能減退和口腔干燥是最常見和最重要的并發(fā)癥。其中放射治療引起的涎腺功能減退占多數(shù)。
　　頭頸部癌癥放療后的長期幸存者,近64％的人發(fā)生中度到重度的口腔干燥癥狀[1]。涎腺唾液機(jī)能的減退可能導(dǎo)致各種各樣的后遺癥及其一系列的健康問題,如口腔干燥、吞咽困難、味覺改變或喪失、猖獗性齲齒和口腔念珠菌病等。最終,這

2、些并發(fā)癥可能導(dǎo)致患者營養(yǎng)不足和體重減輕,生活質(zhì)量下降。此外,放射治療引起的唾機(jī)能減退不僅影響患者的生活質(zhì)量[2],而且有些患者不得不因此而終止放療,從而導(dǎo)致腫瘤無法繼續(xù)有效控制[3-5]。而目前的治療方法只能是對癥治療、緩解癥狀,并不能從根本上治療這類疾病。
　　[目的]:本實(shí)驗(yàn)通過給予放射性涎腺損傷小鼠模型局部注射ADSCs/PRF/EPCs復(fù)合物,尋求一種更安全、便捷、有效的促進(jìn)受損涎腺修復(fù)的方法,為臨床涎腺組織工程提供新的思

3、路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]:(一)體外實(shí)驗(yàn):采用消化法分離培養(yǎng)小鼠ADSCs,誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs細(xì)胞,并通過免疫熒光法、細(xì)胞表型流式細(xì)胞術(shù)鑒定、HE染色等方法對兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定;通過大體觀察、掃描電鏡對不同形狀PRF的生物學(xué)特性做相關(guān)研究;同時(shí)通過RCCS系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并用大體觀察法、DiI染色法、HE染色法、掃描電鏡法觀察RCCS系統(tǒng)對細(xì)胞的作用;(二)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):采用直線加速器18Gy局部照射建立小鼠涎腺放射性損傷模型;

4、小鼠隨機(jī)分成5組給予局部注射,通過體重變化、唾液流率、大體觀察、組織學(xué)切片、細(xì)胞凋亡檢測、透射電鏡的方法,觀察不同注射組小鼠頜下腺組織的變化情況。
　　[結(jié)果]:(一)體外實(shí)驗(yàn):1)小鼠ADSCs呈梭形,表達(dá)干細(xì)胞CD分子表型,具有成脂、成骨的分化潛能;2)誘導(dǎo)生成小鼠EPCs呈典型的上皮樣結(jié)構(gòu),可以表達(dá)CD31,有類管腔樣機(jī)構(gòu)形成;3)凝膠狀的PRF可以作為一種很好的天然支架材料,為細(xì)胞生長充當(dāng)載體作用,并且可促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化

5、;4)模擬微重力旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)系統(tǒng)相比于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法能夠更有效的促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化,傳統(tǒng)培養(yǎng)的倍增時(shí)間(3.62795±0.25936)天,旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)的倍增時(shí)間為(2.98975±0.10133)天,倍增時(shí)間更快(P<0.05);(二)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1)放射后小鼠體重減輕,唾液流量減少,3個(gè)月后HE染色可見頜下腺組織結(jié)構(gòu)破壞、幾乎所有的腺泡細(xì)胞發(fā)生液泡化,間質(zhì)有大量的單核細(xì)胞浸潤。透射電鏡觀察可見,正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞,細(xì)胞水腫變性,細(xì)

6、胞核固縮,線粒體腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,細(xì)胞質(zhì)正常成分消失;2)通過對不同分組的3個(gè)月小鼠體重ADSCs組、PRF組、ADSCs/PRF組、ADSCs/PRF/EPCs組的體重分別是27.14±1.57g、29.45±1.65g、36.78±2.78g、39.86±2.42g較PBS組20.78±1.27g,P<0.05;其唾液流率分別為52.75±8.03μl/min、66.5±5.37μl/min、78.37±8.41μl/min、87.

7、25±8.94μl/min較PBS組35.37±7.98μl/min,(P<0.05),唾液分泌延遲時(shí)間80±3.92s、81±5.57s、76±4.36s、72±3.22s較92±4.59s,(P<0.05)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;涎腺組織切片HE染色切片可見PRF/ADSCs/EPCs復(fù)合組中大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,未見明顯的空泡樣結(jié)構(gòu),有類似新生的腺泡和新生血管樣結(jié)構(gòu)生成;涎腺組織切片透射電鏡觀察,該組同樣可見細(xì)胞基本完整,細(xì)胞膜和胞核清晰完

8、整,細(xì)胞質(zhì)中可見大量正常的細(xì)胞器,且該組細(xì)胞凋亡率為10.6±1.6%較PBS組53.6±3.4%具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與PBS對照組相比,小鼠的唾液量得到一定程度的恢復(fù),各項(xiàng)指標(biāo)均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);說明ADSCs/PRF/EPCs復(fù)合可以一定程度的保護(hù)和促進(jìn)腺泡細(xì)胞的修復(fù)和再生。
　　[結(jié)論]:(一)體外實(shí)驗(yàn):1.成功地建立了小鼠ADSCs細(xì)胞系;2.成功將小鼠ADSCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成為EPCs;3.成功地制備

9、了PRF以及驗(yàn)證其作為天然生物支架材料和載體的可行性;4.微重力旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器可以更有效的促進(jìn)細(xì)胞增殖,為下一步的體內(nèi)研究提供了豐富的種子細(xì)胞來源;(二)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1.成功地建立了小鼠涎腺放射性損傷的動(dòng)物模型;2.局部注射ADSCs/PRF/EPCs能夠有效恢復(fù)小鼠放射性損傷涎腺的功能。該方法具有材料來源廣泛、操作方便、安全有效、對組織創(chuàng)傷小的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明該復(fù)合注射組具有促進(jìn)受損涎腺組織血管化,腺泡細(xì)胞修復(fù),有效刺激小鼠的唾液流率,改