干細(xì)胞對(duì)小鼠涎腺放射損傷的預(yù)防實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【背景】
　　唾液是人體生存所不可缺少的,由人體涎腺所分泌,它能幫助人體消化食物,殺菌、清潔和保護(hù)口腔。然而對(duì)于頭頸部惡性腫瘤患者,大部分要接受放療,而涎腺也位于頭頸部,這就不可避免的造成涎腺細(xì)胞不可逆性放射損傷,導(dǎo)致其分泌功能降低或喪失,給患者帶來極大的困擾,目前防止涎腺損傷的方法也只能是盡量減少腺體受到照射。而對(duì)于涎腺區(qū)腫瘤,部分放射損傷是不可避免的,目前在臨床上對(duì)于涎腺損傷尚沒有根本性的治療措施,如何從根本上預(yù)防涎腺放射損傷

2、,為病人解決痛苦呢,這成為目前廣大學(xué)者及醫(yī)生的難題。隨著組織工程研究的日益豐富,涎腺組織工程技術(shù)也逐漸發(fā)展起來,種子細(xì)胞是組織工程的重要因素,涎腺細(xì)胞屬于成熟的終末分化細(xì)胞,不能無限增殖,對(duì)于涎腺損傷的患者涎腺干細(xì)胞提取困難,隨著干細(xì)胞的多向分化潛能逐漸被發(fā)掘出來,其他來源的成體干細(xì)胞能否也應(yīng)用于涎腺損傷的研究呢?因此本實(shí)驗(yàn)探討用脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ASCs)及骨髓干細(xì)胞(bonemesench

3、ymalstemcells,BMSCs)來預(yù)防涎腺放射損傷,研究其作用機(jī)制,為臨床預(yù)防患者口干癥狀提供一種新的思路。
　　【目的】
　　探討干細(xì)胞預(yù)防涎腺放射損傷的可行性,為應(yīng)用于臨床預(yù)防放療患者口干癥狀提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　【方法】
　　1.從雄性小鼠中分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(ASCs)及骨髓干細(xì)胞(BMSCs),通過活細(xì)胞照相及HE染色,細(xì)胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定,以細(xì)胞表面CD分子測(cè)定,對(duì)干細(xì)胞特性

4、進(jìn)行鑒定。
　　2.小鼠涎腺放射損傷模型的建立。將雌性小鼠分為6組,每組10只,瓦里安直線加速器分別進(jìn)行對(duì)每組小鼠給予0Gy,12Gy,15Gy,18Gy,21Gy,24Gy進(jìn)行頭頸部局部照射,照射后一月內(nèi)觀察小鼠體重變化,照射后一周,一個(gè)月進(jìn)行血象分析,照后2,3,4月進(jìn)行唾液流量測(cè)定,組織切片HE染色,透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu),TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
　　3.干細(xì)胞預(yù)防小鼠涎腺放射損傷實(shí)驗(yàn)。分為四組,對(duì)照組(cont

5、rol),照射+生理鹽水(IR+NS),照射+脂肪干細(xì)胞(IR+ASCs),照射+骨髓干細(xì)胞(IR+BMSCs)。選取兩種第三代干細(xì)胞對(duì)照射后各組小鼠立即進(jìn)行尾靜脈注射,每周兩次,每次注射細(xì)胞濃度為2×105/ml,每次注射0.2ml,連續(xù)注射8周,注射后8周進(jìn)行檢測(cè)指標(biāo)。
　　4.各組小鼠的涎腺功能測(cè)定:包括體重測(cè)量,腺體重量測(cè)量,唾液流量的測(cè)定。
　　5.各組小鼠的涎腺組織形態(tài)學(xué)觀察,包括HE染色,PAS染色,透射電鏡觀

6、察組織超微結(jié)構(gòu),TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)組織損傷情況。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法,采用SPSS19.0軟件,采用ANOVA單因素方差分析法和t檢驗(yàn)對(duì)上述采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行各組間統(tǒng)計(jì)分析,比較各組間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　【結(jié)果】
　　1.從小鼠體內(nèi)分離培養(yǎng)的ASCs,形態(tài)呈梭形,具有較強(qiáng)的增殖能力,能表達(dá)脂肪干細(xì)胞CD29、CD44和CD90,不表達(dá)CD31、CD34和CD45,能向成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化能力,表明實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)

7、出ASCs。
　　2.用全骨髓法成功從小鼠體內(nèi)培養(yǎng)出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)呈梭形,多邊形,三角形及不規(guī)則形,細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44和CD90,不表達(dá)CD31、CD34和CD45，有向成脂及成骨分化的潛能,有自我更新和增殖能力,但沒有脂肪干細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。
　　3.照射組小鼠在照射后體重輕微下降,血常規(guī)各項(xiàng)較對(duì)照組下降,唾液流量率較對(duì)照組有明顯下降,而且隨時(shí)間延長(zhǎng),照射劑量越大,降低幅度也越大,各照射組的唾液流量與未照

8、射組相比有明顯差異。
　　4.組織切片HE顯示照射組頜下腺組織較對(duì)照組有明顯損傷,腺泡細(xì)胞數(shù)量減少,結(jié)構(gòu)紊亂,劑量越大,損傷越明顯;電鏡下可見腺泡細(xì)胞水腫變性壞死,細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂;凋亡檢測(cè)可見照射組組織大量凋亡細(xì)胞,18Gy照射組的凋亡率為21±2.5％,正常組織凋亡細(xì)胞幾乎為0。
　　5.干細(xì)胞注射后8周,進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè),IR+ASCs組,IR+BMSCs組較IR+NS組在小鼠體重、腺體重量及唾液流量上都稍增加,但較未照射組偏

9、低,IR+ASCs組較IR+BMSCs組稍增加,各組之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.細(xì)胞注射后8周,不同組的HE染色結(jié)果顯示:照射組腺泡細(xì)胞數(shù)量較未照射組減少,各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,注射細(xì)胞組較注射NS組細(xì)胞數(shù)量稍增加。
　　7.PAS染色同樣可見照射組較對(duì)照組組織切片染色較淺,而IR+注射細(xì)胞組較IR+NS組顏色稍深,可見照射組腺泡細(xì)胞的糖原明顯減少,而注射細(xì)胞組較注射NS組糖原成分稍增加。
　　8.透射電鏡觀察組織

10、超微結(jié)構(gòu)顯示:對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好,而IR+NS組細(xì)胞水腫,細(xì)胞器破壞最嚴(yán)重,結(jié)構(gòu)消失,溶酶體明顯增加,注射細(xì)胞組細(xì)胞形態(tài)基本正常,能見到新生的小血管。
　　9.各組織細(xì)胞凋亡檢測(cè):從各凋亡切片可見:對(duì)照組幾乎為0,IR+NS組凋亡最明顯,凋亡指數(shù)為:38±2.3%,IR+ASCs組的凋亡指數(shù)為23±1.8%,IR+BMSCs組凋亡指數(shù)為28±2.1%,注射細(xì)胞能降低照射后組織的細(xì)胞凋亡率,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

11、0.05)。
　　【結(jié)論】
　　1.從小鼠體內(nèi)可以成功分離出脂肪干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,具有多向分化潛能,實(shí)驗(yàn)證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沒有脂肪干細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。
　　2.頜下腺放射損傷有劑量依賴性,照射后兩個(gè)月,18Gy照射組組織切片有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),與正常對(duì)照組相比,放射組小鼠下頜下腺的唾液流量降低接近正常組的60%,是研究涎腺放射損傷的理想的放射模型。
　　3.照射后注射干細(xì)胞組的涎腺組織無論在功能上和形態(tài)學(xué)