應用軟骨脫細胞膜片構建軟骨的實驗研究.pdf

1、軟骨組織的再生能力低，所以軟骨缺損或畸形一直是臨床治療的難題，組織工程技術的發(fā)展為軟骨修復提供了新的治療手段。軟骨脫細胞基質(zhì)作為天然材料有望成為組織工程軟骨構建的理想支架，但是由于它是致密的結締組織，細胞不易完全脫除，后續(xù)細胞長入也有困難，因而限制了其在該領域的應用。
　　 本研究對軟骨脫細胞材料在軟骨組織工程中的應用提出了新的方法--應用軟骨膜片的形式進行脫細胞處理，以“三明治”法復合軟骨細胞進行軟骨構建，從而解決了傳統(tǒng)軟骨脫

2、細胞材料應用的難題。
　　 課題分四部分對軟骨脫細胞膜片開展了系列研究。
　　 第一章軟骨脫細胞膜片的制備和組織學檢測
　　 方法：應用豬耳軟骨連續(xù)切片獲得10μm和30μm兩種厚度的軟骨膜片，經(jīng)1％SDS脫細胞后漂洗、凍干，對脫細胞程度進行評價，評價手段主要為兩種：HE染色和DAPI染色，并應用掃描電鏡對膜片和接種細胞后的膜片進一步鑒定。結果：經(jīng)HE染色和DAPI染色鑒定，軟骨膜片經(jīng)脫細胞后軟骨陷窩內(nèi)無軟骨細胞

3、，掃描電鏡進一步確定了這個結果，10μm膜片通透性比30μm好，膜片和細胞組織相容性好。
　　 第二章應用“三明治”法復合軟骨細胞構建軟骨組織
　　 方法：將從豬耳廓分離培養(yǎng)的軟骨細胞分別以25、50、100、200×106/ml重懸，5μl一滴與10μm或30μm軟骨脫細胞膜片以“三明治”法層層疊加20層構建軟骨，體外培養(yǎng)4周后，構建后的軟骨進行組織學鑒定，以得出合適的接種細胞濃度和膜片厚度，再利用這個結果，進一步比較

4、體外培養(yǎng)和植入裸鼠體內(nèi)后軟骨形成差異，利用10μm膜片接種密度為100×106/ml構建軟骨，分四組：體外培養(yǎng)4周、體外培養(yǎng)16周、體外培養(yǎng)4周+植入體內(nèi)4周、體外培養(yǎng)4周+植入體內(nèi)12周，分別比較HE、藏紅花、甲苯胺藍、Ⅱ膠原染色和彈性模量。結果：利用10μm膜片接種密度為100×106/ml構建的軟骨效果較好，植入體內(nèi)后軟骨表型穩(wěn)定，材料降解明顯，植入12周后彈性模量可達正常軟骨的87％左右。
　　 第三章利用軟骨脫細胞膜片

5、技術構建一定形態(tài)的軟骨
　　 方法：預先制備設計軟骨脫細胞膜片為圓形、三角形、長方形，應用“三明治”法層層疊加構建相應形態(tài)軟骨，體外培養(yǎng)4周后組織學檢驗；或將制作好的膜片和軟骨細胞貼附于人耳形態(tài)的鈦支架上，體外培養(yǎng)2天后植入裸鼠4周。結果：形成的組織工程軟骨形態(tài)與預制的膜片形態(tài)一致，無收縮變形；植入裸鼠體內(nèi)的人耳形狀細胞-材料復合物能形成完整形態(tài)的組織工程人耳形狀軟骨。
　　 第四章軟骨脫細胞膜片的免疫原性研究
　

6、　 方法：以羊作為模型，將來自于自體、同種異體(異體羊)、異種(豬)軟骨脫細胞膜片復合羊自體軟骨細胞構建的組織植入在羊體內(nèi)，植入體內(nèi)4周后組織學檢查軟骨形成和評價免疫反應程度。結果：同種異體的膜片構建的軟骨較異種的好，可用于大動物的軟骨組織工程構建。
　　 本研究創(chuàng)新性地應用軟骨脫細胞膜片復合“三明治”法構建組織工程軟骨，脫細胞基質(zhì)為組織構建提供了天然的支架，這一方法可以用于指導其他組織的構建，大動物實驗初步表明同種異體的膜片