中藥生肌液-骨髓基質(zhì)細(xì)胞-脫基質(zhì)骨復(fù)合物修復(fù)兔橈骨缺損的研究.pdf

1、臨床上各種原因引起的骨缺損很常見，且治療困難。目前采用的自體骨和異體骨移植均有各自的不足之處：自體骨移植的骨量受到限制，另外也增加了病人的痛苦；而異體骨移植可能出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)和其它的并發(fā)癥。1987年美國科學(xué)基金會(huì)提出組織工程概念，國內(nèi)外組織工程研究取得令人注目的階段性研究成果，應(yīng)用組織工程骨修復(fù)骨缺損將成為可能，將組織工程骨用于骨缺損的修復(fù)是臨床治療的趨勢(shì)所在。傳統(tǒng)外用中藥生肌膏對(duì)于感染性開放骨折療效顯著，將其有效成分優(yōu)化制備成生肌

2、液。本實(shí)驗(yàn)旨在研究體內(nèi)環(huán)境中生肌液對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Marrow StromalCells，MSCs)增殖和分化功能的影響，為骨組織工程研究活性骨誘導(dǎo)因子提供新思路。 目的： 1.建立和完善MSCs分離和培養(yǎng)技術(shù)，最大限度的獲得MSCs。 2.將中西醫(yī)結(jié)合治療感染性開放骨折的特色中藥應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)研究，觀察生肌液在體內(nèi)對(duì)MSCs增殖和分化的影響，從而進(jìn)一步加深我們對(duì)中藥作用的認(rèn)識(shí)，探索中藥在骨組織工程領(lǐng)域的新應(yīng)

3、用。 方法： 1.抽取大耳白兔脛骨骨髓，經(jīng)密度梯度離心-貼壁篩選，獲取MSCs并培養(yǎng)、擴(kuò)增。 2.以纖維蛋白膠和脫基質(zhì)骨(Dematrix Bone，DMB)為MSCs載體，構(gòu)建組織工程骨，分別為：空白組(DMB-MSCs復(fù)合物)；實(shí)驗(yàn)組包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphgenetic Protein，BMP)組(含BMPDMB-MSCs復(fù)合物)、生肌液組(生肌液-DMB-MSCs復(fù)合物)、BMP+生肌液組

4、(生肌液-含BMPDMB-MSCs復(fù)合物)。 3.制作標(biāo)準(zhǔn)的兔橈骨10mm完全缺損模型，植入已構(gòu)建的組織工程骨，制作修復(fù)模型。 4.術(shù)后觀察動(dòng)物的一般情況，分別于4、8、12、16周攝X線片動(dòng)態(tài)觀察新生骨痂生長(zhǎng)；4、8、12、16周取材進(jìn)行組織學(xué)染色觀察骨缺損修復(fù)過程中的細(xì)胞學(xué)變化；4周進(jìn)行BrdU免疫組化染色觀察標(biāo)記的MSCs在骨修復(fù)中的作用；8周進(jìn)行Ⅰ型膠原免疫組化染色觀察骨缺損修復(fù)中Ⅰ型膠原的分泌活性、Von Ko

5、ssa染色以及四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記觀察新骨形成狀態(tài)；16周取材進(jìn)行標(biāo)本大體觀察和骨密度檢測(cè)以綜合評(píng)價(jià)骨缺損修復(fù)情況。 結(jié)果： 1.采用密度梯度離心-貼壁篩選的方法，可獲得大量骨髓中的MSCs。MSCs于原代培養(yǎng)13-14天，80％融合，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后MSCs為成纖維細(xì)胞樣形態(tài)結(jié)構(gòu)，呈指紋狀生長(zhǎng)，具有強(qiáng)大的增殖能力。 2.動(dòng)態(tài)放射學(xué)和組織學(xué)檢查結(jié)果提示生肌液-BMP組編織骨生成量最多，成熟也最早；BMP組骨痂生成量

6、和成熟度都強(qiáng)于生肌液組；空白組最差，骨痂生長(zhǎng)緩慢，量少且幼稚。 3.組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)骨缺損修復(fù)兼有膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨的方式，且新生編織骨貼支架材料生長(zhǎng)；含生肌液組新生血管較其它組更豐富。 4.術(shù)后4周標(biāo)本BrdU標(biāo)記可見支架材料中細(xì)胞胞核呈深棕色，顯示植入的MSCs參與了骨缺損修復(fù)。 5.術(shù)后8周標(biāo)本四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記觀察四環(huán)素?zé)晒鈳У牧炼燃皫чg寬度：BMP+生肌液組>BMP組>生肌液組>空白組。 6.術(shù)后8

7、周標(biāo)本Ⅰ型膠原免疫組化觀察顯示大量骨基質(zhì)生成，且各實(shí)驗(yàn)組明顯多于空白組。 7.術(shù)后8周標(biāo)本Von Kossa染色顯示骨折斷端和支架材料旁新生編織骨。 結(jié)論： 1.采用密度梯度離心-貼壁篩選法，分離大耳白兔骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞層，可獲得具有強(qiáng)大增殖能力、高純度的MSCs； 2.在體內(nèi)環(huán)境，中藥生肌液具有促進(jìn)MSCs增殖和分化為成骨細(xì)胞的能力。生肌液與BMP復(fù)合能極大增強(qiáng)BMP的功能，更加有效的促進(jìn)成骨；