應(yīng)用生物反應(yīng)器及體外微團(tuán)培養(yǎng)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 關(guān)節(jié)軟骨主要是由軟骨細(xì)胞及其周圍的外基質(zhì)組成的無(wú)血管組織。關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨科的較為常見(jiàn)的疾患，其損傷后自我修復(fù)能力很弱，至今軟骨缺損的修復(fù)仍無(wú)理想的方法。創(chuàng)傷、骨軟骨炎、骨性關(guān)節(jié)炎、髕骨軟化等均可引起軟骨以及軟骨下骨的損傷和（或）缺損。軟骨損傷的修復(fù)一直是骨關(guān)節(jié)外科的一個(gè)難題，目前對(duì)于輕度的軟骨損傷主要以保守療法為主，而晚期嚴(yán)重的軟骨損傷可引起嚴(yán)重的膝關(guān)節(jié)疼痛，畸形等，通常采用人工關(guān)節(jié)置換術(shù)為主。本課題采用組織工程技術(shù)，

2、體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bMSCs），用微團(tuán)培養(yǎng)方法經(jīng)過(guò)特定生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)生成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞后，將軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞種植于三維多孔β—磷酸三鈣（β—TCP）生物陶瓷支架材料上置于生物反應(yīng)器中復(fù)合培養(yǎng)，構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，觀察細(xì)胞在支架材料上的黏附、伸展和增殖情況，并模仿馬賽克骨軟骨移植術(shù)用塑型良好的骨軟骨復(fù)合體修復(fù)動(dòng)物軟骨缺損，觀察其修復(fù)情況，探討以β—TCP為載體建造組織工程化軟骨修復(fù)骨軟骨缺損的可行性。 材料和方法：

3、 1.取4—10月齡健康比格犬3只，無(wú)菌穿刺抽取髂骨骨髓6—7ml，Percoll分離法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定。取第3代的bMSCs，根據(jù)滴加生長(zhǎng)因子的不同，分為三組：Ⅰ組軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)組，滴加軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（組成：BMP—2200ng／ml，IGF—Ⅰ10ng／ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白6．25ug/ml，地塞米松10—7M/L，維生素C50ug/ml）；Ⅱ組成骨細(xì)胞誘導(dǎo)組，滴加成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（組成：地塞米松

4、100nmol／L，β—甘油磷酸鈉10mmol/L，維生素C0．05mmol／L）；Ⅲ組空白對(duì)照組，未滴加任何誘導(dǎo)因子。三組中常規(guī)加入含10%胎牛血清的H—DMEM液，采用體外微團(tuán)培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)組行MTT法觀察細(xì)胞增殖狀況，細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)糖胺聚糖的含量，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞Ⅱ型膠原的分泌，以觀察bMSCs向軟骨細(xì)胞分化的情況；成骨細(xì)胞誘導(dǎo)組行堿性磷酸酶染色和礦化結(jié)節(jié)染色以觀察

5、bMSCs向成骨細(xì)胞分化的情況。 2.取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)14天的bMSCs，經(jīng)檢驗(yàn)誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞后，分別調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，與β—磷酸三鈣（β—TCP）復(fù)合培養(yǎng)1天，置入生物反應(yīng)器中培養(yǎng)21天，進(jìn)行復(fù)合組織的病理形態(tài)學(xué)觀察；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)備用。β—磷酸三鈣（β—TCP）及軟骨細(xì)胞—成骨細(xì)胞—β—磷酸三鈣支架復(fù)合體進(jìn)行掃描電鏡觀察。以觀察β—TCP支架材料的結(jié)構(gòu)、孔隙率；觀察軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞在β—磷酸三鈣支架內(nèi)黏附和

6、生長(zhǎng)增殖情況。 3.取10—12月齡健康比格犬9只，在實(shí)驗(yàn)犬的股骨滑車處鉆直徑4．5mm，深度4．5mm的骨軟骨缺損，深達(dá)軟骨下區(qū)。隨機(jī)分為3組：A組，作為實(shí)驗(yàn)組，9只，左膝軟骨缺損處深層植入軟骨細(xì)胞—成骨細(xì)胞—β—磷酸三鈣復(fù)合體；B組，作為陰性對(duì)照組，9只，左膝軟骨缺損處植入軟骨細(xì)胞—β—磷酸三鈣復(fù)合體；C組，空白對(duì)照組，9只，左膝軟骨缺損處植入空白β—磷酸三鈣。分別于術(shù)后12、16周處死取材，進(jìn)行大體和組織學(xué)觀察。

7、結(jié)果: 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞接種后1—3日可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁，呈短梭形。3日后可見(jiàn)細(xì)胞集落形成，7—8日廣泛集落形成。12—14日細(xì)胞形成單層。傳代細(xì)胞貼壁快，7—8日形成單層，細(xì)胞核大，胞漿內(nèi)顆粒多。取P3代細(xì)胞進(jìn)行微團(tuán)誘導(dǎo)培養(yǎng)，加入細(xì)胞因子后，細(xì)胞生長(zhǎng)加快，微團(tuán)中央形成細(xì)胞團(tuán)塊，邊緣呈漩渦狀生長(zhǎng)。 2.加入細(xì)胞因子BMP—2（Ⅰ組）的MTT吸光度值、培養(yǎng)上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和Ⅱ

8、型膠原分泌均明顯高于對(duì)照組（Ⅲ組）。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性的bMSCs胞漿染色為黃色或棕黃色。堿性磷酸酶（ALP）染色顯示成骨細(xì)胞胞質(zhì)中陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀；礦化結(jié)節(jié)染色表明成骨細(xì)胞可形成肉眼可見(jiàn)的白色礦化結(jié)節(jié)，常用茜素紅法染色，染料品種的不同，礦化結(jié)節(jié)呈顯不同的紅色。 3.電鏡觀察：掃描電鏡顯示β—磷酸三鈣（β—TCP）材料平均孔徑為400～600μm，孔隙率為75%±10%，氣孔溝通率達(dá)100%。復(fù)合材料顯示軟

9、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞在β—磷酸三鈣（β—TCP）支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見(jiàn)到細(xì)胞分泌的基質(zhì)和細(xì)胞偽足的鉚固作用，表明支架材料具有良好的細(xì)胞親和性。 4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 大體觀察：術(shù)后16周，實(shí)驗(yàn)組缺損修復(fù)區(qū)組織與周圍關(guān)節(jié)軟骨相整合，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無(wú)差異；陰性對(duì)照組缺損區(qū)修復(fù)組織與周圍軟骨部分整合在一起，光澤較差；空白對(duì)照組缺損處修復(fù)組織低凹，新生組織軟，無(wú)光澤，與周圍軟骨組織

10、區(qū)別明顯。組織學(xué)觀察：術(shù)后16周，實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)軟骨厚度與正常軟骨組織接近，細(xì)胞排列出現(xiàn)明顯規(guī)律，表面層的軟骨細(xì)胞平行關(guān)節(jié)面排列，深層縱向排列，與透明軟骨組織相似，軟骨下骨形成，潮線基本恢復(fù)，與周圍正常軟骨連接較好。陰性對(duì)照組軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，中央修復(fù)區(qū)大部分為纖維組織修復(fù)。空白對(duì)照組缺損區(qū)內(nèi)主要為纖維組織。 結(jié)論： 1. bMSCs為軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞。取材方便，Percoll分離法分離可以獲取大量骨髓間充質(zhì)干

11、細(xì)胞，體外培養(yǎng)能夠保持其表形的穩(wěn)定性，易于傳代擴(kuò)增，在一定誘導(dǎo)條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。 2. BMP—2在促進(jìn)bMSCs細(xì)胞增殖和向軟骨細(xì)胞定向分化方面有顯著的作用，均明顯高于對(duì)照組，是目前誘導(dǎo)bMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化的理想細(xì)胞因子。 3.三維培養(yǎng)方法是目前誘導(dǎo)bMSCs向軟骨方向分化的最理想的培養(yǎng)方法。 4. β—磷酸三鈣（β—TCP）支架是理想的軟骨組織工程支架材料。具有良好的孔隙率和