應(yīng)用旋壁生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細胞.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷、缺損所導(dǎo)致的剝脫性骨軟骨炎、骨性關(guān)節(jié)炎這些疾病，一直缺乏有效的治療手段。主要原因是因為人體關(guān)節(jié)軟骨細胞生長緩慢，難以完成自身修復(fù)。 近年來，隨著組織工程(Tissue Engineemg)技術(shù)的介入，對該病的治療有了新的突破。自體軟骨細胞移植(Autologous Chondrocyte Implantation，ACI)成為目前治療關(guān)節(jié)軟骨缺損疾病的最佳途徑。 ACI通過體外培養(yǎng)、擴增患者自體軟骨細胞，

2、然后移植到病損處，修復(fù)軟骨缺損。傳統(tǒng)單層培養(yǎng)(monolaver)方法可以進行軟骨細胞體外培養(yǎng)和擴增，但這種方法細胞擴增速度有限，且軟骨細胞容易失去其分化表型。因此在體外培養(yǎng)時如何快速獲得大量有良好分化表型的軟骨細胞，是ACI修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)鍵問題。 復(fù)習(xí)文獻后發(fā)現(xiàn)，旋壁生物反應(yīng)器(Rotating W_all VesselBioreactor，RWVB)對多種細胞及組織的體外培養(yǎng)，包括軟骨細胞，都有優(yōu)于傳統(tǒng)單層培養(yǎng)的效果。于是

3、，進行了使用RWVB作關(guān)節(jié)軟骨細胞體外培養(yǎng)的嘗試。 本研究使用生物反應(yīng)器(Bioreactor)進行兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng)，利用細胞培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)等技術(shù)，觀察細胞存活率、生長曲線、細胞代謝和組織形態(tài)學(xué)的改變，并與單層培養(yǎng)作以比較，探討更加合理的細胞體外培養(yǎng)方式。 目的 選用旋壁生物反應(yīng)器對兔關(guān)節(jié)軟骨細胞進行體外培養(yǎng)，并與傳統(tǒng)單層培養(yǎng)方法作以比較。為改進軟骨細胞體外培養(yǎng)方法提供依據(jù)。 方法

4、1 無菌條件下切取3周齡兔關(guān)節(jié)表面軟骨組織，酶消化法分離提取，獲得原代(第O代)關(guān)節(jié)軟骨細胞。 2 方瓶培養(yǎng)并傳代。收集第l代軟骨細胞分為兩組，A組使用24孔板單層培養(yǎng)；B組使用旋壁生物反應(yīng)器三維培養(yǎng)。 3 用倒置相差顯微鏡、細胞染色等方法對兩組細胞生長過程進行觀察、監(jiān)測、鑒定，比較兩種培養(yǎng)方法對細胞活力、增殖速度、Ⅱ型膠原產(chǎn)量的影響。在培養(yǎng)開始后每天分別對兩組細胞取樣，MTT法繪制生長曲線，計算細胞倍增時間，作數(shù)據(jù)

5、分析。 結(jié)果 1 形態(tài)學(xué)觀察顯示：兩組兔關(guān)節(jié)軟骨細胞體外培養(yǎng)后24h開始貼壁。A組細胞外形為圓形或三角形，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞體積變大，向梭形發(fā)展。B組軟骨細胞外形始終保持圓形或橢圓形，細胞呈團簇聚集生長。 2 生長曲線表明，兩組細胞均在培養(yǎng)48h左右進入指數(shù)生長期，A組細胞相對B組細胞增長緩慢。B組細胞的平均倍增時間顯著短于A組細胞，檢測數(shù)據(jù)分析有統(tǒng)計學(xué)差異。 3 甲苯胺藍染色及免疫組化染色提示