幾丁糖作為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)支架的實驗研究.pdf

1、實驗?zāi)康?選用幾丁糖作為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)支架,并用卵磷脂及多聚賴氨酸包埋,同時選用TGF-β<,1>調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生長,探索二者對體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用,為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)提供實驗依據(jù).實驗方法:無菌條件下分離4周齡日本大耳白兔的膝關(guān)節(jié),切取關(guān)節(jié)透明軟骨,剪成約0.5-1mm<'3>大小碎塊,Ⅱ型膠原酶消化3.5-4小時,吹打,離心,清洗,反復(fù)消化3次,收集關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,以4.8×10<'6>/ml種植于培養(yǎng)瓶,加入DMEM培

2、養(yǎng)液4ml,于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞生長至約90％融合時,胰蛋白酶消化,傳代,收集第一代軟骨細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,濃度為4.5×10<'7>/ml.將第一代軟骨細(xì)胞懸液100μl滴加到卵磷脂及多聚賴氨酸包埋后的幾丁糖支架上,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4小時后,加入DMEM培養(yǎng)液100μl,96孔板內(nèi)培養(yǎng),每日換液.實驗組加入TGF-β<,1>(10ng/ml),對照組不加入TGF-β<,1>.觀測指標(biāo):(1)大體及倒置顯微鏡觀察、(2)組織學(xué)觀察、(3)

3、Ⅱ型膠原免疫組化檢測、(4)掃描電鏡觀察、(5)細(xì)胞含量MTT測定、(6)統(tǒng)計學(xué)分析.實驗結(jié)論:卵磷脂及多聚賴氨酸包埋后的幾丁糖支架親水性和細(xì)胞粘附性較好.細(xì)胞-支架復(fù)合物中細(xì)胞周圍及胞漿內(nèi)Ⅱ型膠原均呈陽性,隨著培養(yǎng)時間的延長,陽性逐漸增強,說明軟骨細(xì)胞于支架中生長良好.MTF檢測細(xì)胞增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)包埋幾丁糖支架對軟骨細(xì)胞的增殖無抑制作用.該實驗在細(xì)胞-支架復(fù)合物中加入TGF-β<,1>后,細(xì)胞在支架上保持了正常的形態(tài),生長迅速,同