體外兔軟骨細(xì)胞的分離，培養(yǎng)與鑒定的研究.pdf

1、背景：骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特性的慢性關(guān)節(jié)疾病，因關(guān)節(jié)軟骨退化損傷導(dǎo)致關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生所致。是臨床上多發(fā)的老年退行性疾病。隨著我國的老齡化，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率越來越高，該病造成的疼痛及活動不便嚴(yán)重影響老人們的生活作息[1]?，F(xiàn)今對該病的治療仍然缺乏特效藥，軟骨的破壞過程中可能影響到軟骨細(xì)胞，而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子。研究表明再生軟骨細(xì)胞移植能有效的解決軟骨損傷，根治骨性關(guān)節(jié)炎。以前的傳統(tǒng)方

2、法較復(fù)雜繁瑣，且容易污染，引起軟骨細(xì)胞死亡、降低成活率和質(zhì)量，因此尋找簡單體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的方法對骨性關(guān)節(jié)炎的治療非常重要。故本研究的目的是探討體外軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，以獲取大量分裂活躍具有高活力的軟骨細(xì)胞，修復(fù)軟骨缺損，為軟骨細(xì)胞成功移植、治愈骨關(guān)節(jié)炎提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：在體外對兔軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及試驗鑒定，在體外建立軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的體系，培養(yǎng)出大量純度高活性高的軟骨細(xì)胞。為下一步的人工軟骨再造及軟骨移植奠定基礎(chǔ)的

3、理論研究。
　　方法：耳緣靜脈麻醉新西蘭大白兔，在兔子胸口解刨，暴露出心臟動脈，最大量取血，應(yīng)用離心機(jī)制備高濃度血小板血漿，冰箱內(nèi)封存，并防止污染，以備后期應(yīng)用;無菌操作取出兔膝關(guān)節(jié)軟骨，在超凈臺上分離關(guān)節(jié)組織，提取軟骨組織，將其剪成1mm×1mm大小碎片，放入20 ml小燒杯中，PBS磷酸緩沖溶液沖洗3次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的乙二胺四乙酸(EDTA)5ml置于常溫下靜止20分鐘后離心棄上清，加入相當(dāng)3倍體積的0.25％胰蛋白

4、酶，放置37℃恒溫振蕩器內(nèi)消化40 min，輕輕吹打棄去上清液，PBS沖洗2次，按照1∶1比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％Ⅱ型膠原酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％胰蛋白酶各5ml置于37℃恒溫振蕩器內(nèi)消化20 min，4℃低溫高速離心（1000r·min-1）5min，離心后棄上清，加入6ml含0.2％Ⅱ型膠原酶消化液置于37℃恒溫振蕩器內(nèi)進(jìn)行消化，每90分鐘取上清1次，剩余燒杯內(nèi)更換消化液繼續(xù)消化，取含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清(FBS)的DMEM/

5、F12培養(yǎng)基于上清液中和胰蛋白酶，高速離心收集沉淀細(xì)胞，所收集細(xì)胞重懸于DMEM/F12培養(yǎng)液（含10％FBS、青鏈霉素各100μg/ml）中。應(yīng)用機(jī)械-雙酶消化法分離兔軟骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)時實驗組加PRP，對照組常規(guī)培養(yǎng)，通過顯微形態(tài)學(xué)觀察兩組細(xì)胞，運(yùn)用Prism軟件、MTT比色法繪制兩組細(xì)胞增殖生長曲線。應(yīng)用蘇木素-伊紅染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色鑒定軟骨細(xì)胞，對比兩組培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的活性表達(dá)。
　　結(jié)果：改良后的機(jī)械-雙酶分