豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向軟骨細(xì)胞分化的研究.pdf

1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)是一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，在體內(nèi)外適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)環(huán)境下可以分化成為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)、肌腱及韌帶等多種細(xì)胞和組織。該細(xì)胞來(lái)源充足，取材方便，增殖能力強(qiáng)，可以在體外大規(guī)模擴(kuò)增而不丟失多向分化潛能，并且異體移植免疫排斥反應(yīng)小。目前，已成為應(yīng)用較廣泛的重要種子細(xì)胞之一。為了獲得充足的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源，我們建立了豬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，通過體外培

2、養(yǎng)和生物學(xué)鑒定，證實(shí)其為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，并具有成骨分化性能。通過體外轉(zhuǎn)導(dǎo)pEGFP-C1-TGF-β1入骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，在條件培養(yǎng)基作用下誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化。以期為骨組織工程和軟骨損傷修復(fù)的研究提供新的策略，獲得了以下結(jié)果： 1.無(wú)菌采取豬股骨頭，采用骨鉗鉗破骨髓腔，收集骨髓液于無(wú)菌離心管，沉淀制成懸液接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞為單層貼壁生長(zhǎng)，呈成纖維樣形態(tài)。CD44因子免疫組化鑒定為陽(yáng)性；條件培

3、養(yǎng)基誘導(dǎo)成骨分化，ALP染色陽(yáng)性，并有礦化結(jié)節(jié)生成；結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。開始時(shí)大多為細(xì)長(zhǎng)梭形，增殖速度快，細(xì)胞傳代周期延短，待傳至第7、8代時(shí)細(xì)胞鋪展得寬大而扁薄，增殖速度減慢，細(xì)胞傳代周期延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)增多。 2.從豬外周血淋巴細(xì)胞中抽提總RNA，并用TGF-β1特異性引物擴(kuò)增獲得TGF-β1全基因，并將TGF-β1全基因亞克隆到帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-

4、C1。 3.并用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BMSCs，通過直接熒光觀察pEGFP-C1-TGF-β1融合蛋白在細(xì)胞中的分布定位，結(jié)果在轉(zhuǎn)染后觀察到綠色熒光，間接免疫熒光法檢測(cè)TGF-β1表達(dá)均為陽(yáng)性，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞失去BMSCs典型的成纖維形態(tài)，而呈現(xiàn)出三角、多角形態(tài)。Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染TGF-β1基因后的BMSCs開始表達(dá)軟骨細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物Ⅱ型膠原。 綜上所述，本研究在成功分離培養(yǎng)豬BMSCs的基礎(chǔ)上，將TGF-β