野生型p53基因轉(zhuǎn)染癌細胞增強免疫原性研究.pdf

1、前言：腫瘤疫苗抗腫瘤作用的機理主要依賴于其中的腫瘤抗原，尤其是腫瘤特異性抗原發(fā)揮了重要作用。p53基因是腫瘤抑制基因的一種，其表達的正常蛋白少量存在于胞核內(nèi)。p53基因突變存在于大約50％以上的人類各種惡性腫瘤中，而且p53基因的突變通常會導(dǎo)致腫瘤細胞中p53蛋白的過度表達，已在許多腫瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)了抗p53抗體。來源于過度表達p53蛋白的肽可由MHC I類分子遞呈，于腫瘤相關(guān)表位發(fā)揮作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生p53特異性的CTL反應(yīng)；說明機體存

2、在針對p53的B細胞和T細胞免疫反應(yīng)。因此，p53蛋白可以作為腫瘤抗原進而成為腫瘤免疫治療的靶標(biāo)。 目的：為探討p53基因修飾的U<,14>細胞瘤苗能否增強抗小鼠宮頸癌的主動免疫反應(yīng)，本研究制備p53基因修飾的U<,14>細胞瘤苗并免疫小鼠，觀察其對小鼠宮頸癌U<,14>細胞的細胞毒作用。方法：以SDS-堿裂解法從擴增的E.coli大腸桿菌中提取含wt-p53的質(zhì)粒DNA，運用陽離子脂質(zhì)體Lipofectin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將p53基

3、因?qū)險<,14>細胞，用含G418的選擇性培養(yǎng)基對已轉(zhuǎn)染細胞進行篩選，以獲得穩(wěn)定表達相應(yīng)p53蛋白的U<,14>細胞，用間接免疫細胞化學(xué)方法檢測p53蛋白的表達情況。采用反復(fù)凍融法制備腫瘤細胞瘤苗，然后觀察經(jīng)細胞瘤苗免疫后的小鼠脾細胞對U<,14>的細胞毒作用。實驗分三組：p53-U<,14>細胞瘤苗組；U<,14>細胞瘤苗組；空白對照組。結(jié)果：SDS-堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA通過限制性酶切分析表明，所提取的質(zhì)粒：DNA是含p53質(zhì)粒

4、DNA。陽離子脂質(zhì)體Lipofectin可有效地將p53基因?qū)險<,14>細胞，通過用含G418的選擇性培養(yǎng)基對已轉(zhuǎn)染細胞進行篩選，獲得了抗G418抗性細胞。間接免疫細胞化學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)：p53基因轉(zhuǎn)染細胞中p53蛋白呈陽性表達，表現(xiàn)為細胞核著棕黃色；未轉(zhuǎn)染細胞和陰性對照細胞(一抗用PBS替代)未見p53蛋白表達。MTI比色法檢測發(fā)現(xiàn)，在效靶比為20：1和40：l時，p53-U<,1>4細胞瘤苗刺激的脾細胞殺傷活性較U14細胞瘤苗和空

5、白對照組均有不同程度提高。p53-U<,14>細胞瘤苗組、U<,14>細胞瘤苗組和空白對照組在效靶比為分別為20：l和40：l時，p53-U<,14>細胞瘤苗組與其它兩組比較其殺傷活性均存在極顯著差異(P<0.001)。結(jié)論：用修飾SDS-堿裂解法成功提取含p53基因的質(zhì)粒DNA，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法有效地將該質(zhì)粒DNA導(dǎo)入到小鼠宮頸癌U<,14>細胞內(nèi)，建立p53轉(zhuǎn)染U<,14>細胞系；采用反復(fù)凍融法制得p53-U<,14>瘤苗，