人野生型Mst1基因抑制腫瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1(mammalian sterile20-like kinase1，Mst1)，又稱絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(serine/threonine-protein kinase4，STK4)和應(yīng)激應(yīng)答激酶2(kinase responsive to stress2，KR S2)，是果蠅Hippo基因在哺乳類中的同源基因，編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要參與細(xì)胞生長、增殖、凋亡以及器官大小等的調(diào)控，具有抑癌作用。

2、　　目的:
　　從分子、細(xì)胞及動(dòng)物水平探討Mst1基因的抑癌作用及其部分的分子機(jī)理，模擬腫瘤的基因治療，旨在為腫瘤的基因治療進(jìn)行一些有益的嘗試并提供有參考意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1、人野生型Mst1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　將Mst1 cDNA連接至真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，用卡那霉素抗性篩選，菌落PCR及測序并序列比對(duì)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
　　2、高表達(dá)Mst1基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞He

3、pG2作用的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　用PolyJetTM體外DNA轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2，應(yīng)用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33342染色法觀察高表達(dá)Mst1對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響;RT-qPCR檢測Mst1、CTGF、AREG和Survivin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，Western blot方法檢測MST1、YAP、Phospho-YAP(Ser127)和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

4、，初步探討Mst1基因在體外抑制細(xì)胞HepG2生長的分子機(jī)制。另外，我們將MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)與Western blot方法相結(jié)合，初步探討MST1蛋白的表達(dá)和活化與DDP誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)系。
　　3、高表達(dá)Mst1基因?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌生長影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　用pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，初步分析細(xì)胞凋亡情況及MST1、YAP、Phospho-YAP(Ser127)蛋白和Mst1、CTGF、

5、AREG和SurvivinmRNA的表達(dá)水平。用Mst1基因?qū)549細(xì)胞形成的裸鼠移植瘤進(jìn)行模擬基因治療，觀察移植瘤的生長情況，并用免疫組織化學(xué)分析移植瘤中YAP及Phospho-YAP(Ser127)蛋白的表達(dá)，初步探討Mst1基因抑制腫瘤生長的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)菌落PCR、序列測定及比對(duì)結(jié)果顯示成功構(gòu)建了人野生型Mst1基因真核表達(dá)載體pEGFP-N1-Mst1。
　　2、用PolyJetTM體外

6、DNA轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pEGFP-N1-Mst1轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2，細(xì)胞生長抑制率及細(xì)胞凋亡率明顯升高，且抑制率隨處理時(shí)間的增加而升高，并且上調(diào)MST1的活性片段MST1(amino terminal truncated form，NT)、Caspase-3的活性片段Caspase-3(cleavage，CL)和YAP的磷酸化形式Phospho-YAP(Ser127)水平，顯著下調(diào)CTGF、AREG和Survivin mRNA表達(dá)水平

7、，DDP的干預(yù)具有促進(jìn)MST1功能的效果。經(jīng)DDP干預(yù)， HepG2-MST1細(xì)胞的增殖活性顯著低于HepG2-Vect細(xì)胞(P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著高于HepG2-Vect細(xì)胞(P＜0.05），HepG2細(xì)胞中MST1(NT)和Phospho-YAP(Ser127)的水平都隨DDP干預(yù)時(shí)間的延長而逐漸升高，但MST1和YAP蛋白總量并沒有改變。
　　3、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Mst1的A549細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中MST1

8、(NT)和Phospho-YAP(Ser127)水平升高，CTGF、AREG和Survivin mRNA表達(dá)水平下降。應(yīng)用Mst1基因、DDP和Mst1基因聯(lián)合DDP的3個(gè)治療組在27天后的平均瘤塊體積和重量均顯著低于Control和陰性對(duì)照組(P＜0.01)，平均抑瘤率分別為(32.30±1.87)％、(51.77±3.98)％和(73.01±1.22)％，并伴隨著YAP蛋白的胞核陽性的降低，YAP和Phospho-YAP(Ser12

9、7)蛋白的胞漿陽性的升高。
　　結(jié)論:
　　1、高表達(dá)Mst1基因促進(jìn)HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞凋亡;
　　2、高表達(dá)Mst1基因上調(diào)腫瘤細(xì)胞中MST1(NT)、Caspase-3(CL)和Phospho-YAP(Ser127)蛋白的表達(dá)水平，下調(diào)CTGF、AREG和Survivin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，這可能是高表達(dá)Mst1基因抑制腫瘤生長的分子機(jī)制之一;
　　3、高表達(dá)Mst1能夠增強(qiáng)HepG2細(xì)胞對(duì)DDP