ABCG2介導(dǎo)結(jié)腸癌側(cè)群細胞多藥耐藥和腫瘤啟動能力研究.pdf

1、研究背景：
　　結(jié)腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）近年的報道，結(jié)直腸癌已升至為女性第二位和男性第三位常見的惡性腫瘤。在我國，近年來隨著社會經(jīng)濟水平的不斷上升，人們飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的改變，環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的態(tài)勢。且發(fā)病呈現(xiàn)年青化、進展快的特點。結(jié)腸癌的主要治療方式為手術(shù)，但結(jié)腸癌難以早期發(fā)現(xiàn)，臨床確診并手術(shù)治療的病人多處于Dukes C期，甚至是已有

2、遠處轉(zhuǎn)移灶存在Dukes D期。即使處于Dukes B期，也不能完全排除已存在血行轉(zhuǎn)移的可能。因此，通過化學(xué)藥物治療來抑制腫瘤生長，延長病人的生存時限，仍是結(jié)腸癌治療的主要方法，且越來越為多數(shù)臨床醫(yī)師所重視。然而臨床卻發(fā)現(xiàn)不同病人間的化療效果千差萬別。隨著研究的進一步深入發(fā)現(xiàn)，化療效果差主要與腫瘤產(chǎn)生抗（耐）藥性有關(guān)，腫瘤的耐藥性與耐藥基因的表達和腫瘤干細胞的啟動腫瘤形成、生長有密切關(guān)系。如何減少結(jié)腸癌的耐藥性、提高化療療效，成為臨床值

3、得研究的課題。
　　越來越多的證據(jù)表明，腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗的主要原因是腫瘤干細胞（CSCs）的存在。腫瘤干細胞是一群小亞群細胞，表現(xiàn)出不受控制，高度有效的腫瘤啟動性，能表達CD133和CD44等干細胞表面標(biāo)志物，具有自我更新和高度分化的能力，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。側(cè)群（SP）細胞是指能將進入細胞內(nèi)的熒光染料Hoechst33342排出細胞外而使細胞呈低染狀態(tài)的亞群細胞。研究者在眾多實體瘤組織中陸續(xù)檢測到側(cè)群細胞的存在，進一步研究

4、發(fā)現(xiàn)，側(cè)群細胞表現(xiàn)出自我更新、無限增殖及強致瘤性，具有干細胞的許多特征，也能高表達C-kit、CD133和干細胞抗原（Sca）-1等干細胞表面標(biāo)志物。
　　自1996年Goodell及同事發(fā)現(xiàn)SP細胞以來，其后的研究者對SP細胞進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)SP細胞快速泵出Hoechst染料的特性與ABCG2的表達密切相關(guān)，ABCG2可能是SP細胞的細胞表型。ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運體家族的成員之一，在人體正常組織和許多腫瘤組織中表達，最早

5、被定義為多藥物耐藥轉(zhuǎn)運蛋白?？筛咝н\載多種抗腫瘤藥物，包括米托蒽醌、拓撲替康、DNA拓撲異構(gòu)酶抑制劑、羥基喜樹堿類、伊立替康及其活性成分SN-38，加速轉(zhuǎn)運泵轉(zhuǎn)出藥物到細胞外，降低細胞內(nèi)有效化療藥物濃度，導(dǎo)致細胞耐藥。已有研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在大腸癌組織中有著明顯的表達。ABCG2在大腸癌組織的細胞膜上的呈強陽性表達，與大腸癌高的Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處臟器轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后程度相關(guān)。利用單因素和多因素進行相關(guān)生存分析都表明ABCG

6、2在細胞膜上的表達是大腸癌總體生存率的獨立預(yù)后因素，并可能提示其在大腸癌的進展過程中所起的作用。
　　通過以上分析，目前傳統(tǒng)的結(jié)腸癌化療策略主要針對大量的腫瘤細胞本身，而忽視了腫瘤干細胞的潛在影響，以致化療效果難以維持。結(jié)腸癌側(cè)群細胞表達干細胞表面標(biāo)志物，是腫瘤的起始（啟動）細胞，很多研究對結(jié)腸癌側(cè)群細胞的多藥耐藥、抗凋亡和分化能力進行研究，所得結(jié)果卻存在爭議。因此，在我們目前的研究中，我們試圖從結(jié)腸癌組織中用Hoechst333

7、42染料排斥法分離出SP細胞，并鑒定其耐藥特性以及評估其腫瘤形成能力。
　　目的：
　　1、從結(jié)腸癌組織中鑒定分離出側(cè)群細胞，分析其特征。
　　2、研究側(cè)群細胞耐藥基因表達和腫瘤干細胞基因表達情況。
　　3、研究結(jié)腸癌側(cè)群細胞增殖活性和多藥耐藥特性。
　　4、研究結(jié)腸癌側(cè)群細胞腫瘤啟動能力。
　　材料與方法：
　　1、研究材料：①臨床標(biāo)本：結(jié)腸中低分化腺癌標(biāo)本12例；②SW480結(jié)腸癌細胞株；③

8、NOD/SCID小鼠
　　2、結(jié)腸癌組織中側(cè)群細胞的比例：采用流式細胞術(shù)，并結(jié)合抑制劑維拉帕米的應(yīng)用，分選出側(cè)群細胞。
　　3、側(cè)群細胞的腫瘤干細胞基因表達和耐藥基因ABCG2表達：采用免疫細胞化學(xué)和聚合酶鏈反應(yīng)（定量RT-PCR）。
　　4、結(jié)腸癌側(cè)群細胞在體外增殖活性和細胞耐藥測定：采用CCK-8法，酶標(biāo)儀測定OD450值。
　　5、側(cè)群細胞成球和成瘤實驗：超低粘附培養(yǎng)板上培養(yǎng)，細胞懸液皮下注入NOD/SCI

9、D小鼠體內(nèi)形成移植瘤。
　　結(jié)果：
　　1、采用排除DNA結(jié)合染料Hoechst33342分選出的SP細胞占3.3％，維拉帕米可通過阻斷耐藥蛋白的作用使SP細胞減少到0.6%。
　　2、干細胞標(biāo)志物CD147，CD44，和EpCAM在SP細胞的表達呈強陽性，與非SP細胞相比，ABCG2、Nestin、Notch1和Oct-4的基因表達量也更高。
　　3、SP細胞比非SP細胞具有更高的體外增殖活性。
　　4、

10、經(jīng)化療藥物如5-FU，順鉑，紫杉醇，奧沙利鉑治療后，SP細胞比非SP細胞的細胞存活率明顯更高。
　　5、球體形成實驗結(jié)果顯示，第5天SP細胞能夠生長形成球體，但非SP細胞不能；SP細胞形成的球體隨著時間的推移而變大，而非SP細胞只在第10天始形成球體，且體積遠較SP細胞形成的球體小而疏松。經(jīng)過7天培養(yǎng)，SP細胞產(chǎn)生的瘤球數(shù)量明顯高于非SP細胞。
　　6、即使在低濃度時，結(jié)腸癌SP細胞注射到NOD/SCID小鼠也能夠在小鼠體內(nèi)

11、誘生腫瘤細胞球，這些腫瘤的生長比非SP細胞誘生的腫瘤生長更快，而且形成的腫瘤體積更大。
　　結(jié)論：
　　1、結(jié)腸癌組織中存在側(cè)群細胞，且能高表達轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2，采用ABCG2拮抗劑處理后，側(cè)群細胞比例減少，提示結(jié)腸癌側(cè)群細胞由ABCG2介導(dǎo)；
　　2、結(jié)腸癌側(cè)群細胞能高表達腫瘤干細胞表面標(biāo)志物，提示側(cè)群細胞具有腫瘤干細胞特性；
　　3、使用常規(guī)化療藥物處理后，結(jié)腸癌側(cè)群細胞表現(xiàn)出存活率顯著高于非側(cè)群細胞，提示