p84介導結腸癌細胞TFF3-Twist通路調控機制研究.pdf

1、目的：
　　TFF3(Trefoil Factor Family3)又稱腸三葉因子(ITF)，是三葉肽家族的成員之一。其分子結構中含有6個高度保守的半胱氨酸殘基，經(jīng)由3個分子內二硫鍵連接，形成三葉狀特征結構域。TFF3在胃腸粘膜的損傷修復過程中發(fā)揮重要作用，近幾年研究發(fā)現(xiàn):TFF3血清中的含量具有作為臨床腫瘤進展（如胃癌、肺癌等）及患者預后評估生物學標志物的轉化潛能。盡管研究報道TFF3異常高表達與胃腸腫瘤，食管癌，乳腺癌等腫瘤發(fā)

2、生發(fā)展相關，但TFF3參與調節(jié)結腸癌生物學行為的分子機制尚無報道。
　　我們課題組多年來一直致力于探索TFFs在粘膜穩(wěn)態(tài)調控過程的作用機制及其功能，小組前期研究報道:在IEC中，TFF3上調Twist表達從而發(fā)揮其不同于經(jīng)典炎癥信號通路（如:TNF-α）對于IL-8的穩(wěn)態(tài)調控作用。Twist作為堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)家族成員之一，除了作為細胞的上皮-間質轉化(Epithelial-Mesenchymal-Transitio

3、n，EMT)關鍵調控因子介導乳腺癌、前列腺癌、胃癌等腫瘤細胞EMT現(xiàn)象外，還參與血管發(fā)生及染色體不穩(wěn)定過程等信號調控過程。在結腸腫瘤細胞中，我們發(fā)現(xiàn)并報告的TFF3-Twist信號通路受到國際同行的高度關注，這一新的信號軸的發(fā)現(xiàn)被認定為重要的基于Twist靶向腫瘤的新傳導通路之一。近期，我們報道了Twist介導TFF3調節(jié)胃癌細胞遷移運動分子機制，但在結腸腫瘤細胞中TFF3-Twist信號通路是否調節(jié)細胞運動，其精細的上游分子調控機制及

4、其參與的腫瘤細胞生物學行為尚不清楚，將作為本課題的主要研究內容。
　　本研究以結腸癌細胞系及人源標本為研究對象，嘗試確認TFF3上調Twist表達的上游關鍵分子調控機制，解析TFF3-Twist信號通路調節(jié)結腸腫瘤細胞EMT相關遷移的機制及臨床意義。旨在探索結腸腫瘤細胞中TFF3過表達的生物學意義，為臨床TFF3高表達結腸癌早期腫瘤轉移診斷提供具有潛在轉化意義新靶點并為臨床TFF3高表達結腸癌的分子分型提供新的解析視角及實驗證據(jù)。

5、
　　方法：
　　1.構建表達載體及截短、突變載體質粒，慢病毒介導實驗用穩(wěn)轉細胞系。
　　2.組織熒光染色觀察p84和Twist在結腸癌標本的表達及共定位。
　　3.Western Blot驗證p84，β-ARR1及Twist在TFF3穩(wěn)轉細胞系中蛋白水平表達。
　　4.Co-IP和TNT驗證p84與Twist相互作用，進一步通過RNAi干擾抑制B-ARR1表達，檢測p84與Twist的互作變化。
　

6、　5.Confocal顯微技術觀察TFF3誘導下，p84與Twist在細胞核質共定位。
　　6.Western Blot分析p84WT、KA和KD對下游分子β-ARR1和Twist蛋白的表達及核質分布影響。
　　7.Confocal顯微技術觀察p84KA和KD與Twist的共定位。
　　8.RNAi干擾或過表達β-ARR1，通過Western Blot方法檢測其對p84和Twist表達及核質分布影響。
　　9.W

7、estern Blot技術驗證TFF3-p84對組蛋白H3表達及其Serl0磷酸化調節(jié)。
　　10.Confocal顯微技術觀察TFF3誘導E-cad和Vimen的表達改變。
　　11.Western Blot驗證p84介導TFF3調節(jié)EMT標志分子蛋白變化。
　　12.Dual-Luciferase Assay System分析p84-Twist對TFF3下游E-cadherin啟動子轉錄活性影響。
　　13.

8、細胞劃痕遷移實驗檢測TFF3-p84-Twist通路對IEC遷移能力影響。
　　14.免疫組化，F(xiàn)isher's Exact Test及Spearman's檢驗分析TFF3與磷酸化p84在結腸癌組織樣本中的相關性。
　　15.免疫組化分析磷酸化p84與Twist在不同組織類型結腸癌中表達定位相關性及Twist胞質表達與結腸癌轉移相關性。
　　結果：
　　1.TFF3增強β-ARR1介導的p84與Twist互作，并

9、誘導p84-Twist核質共定位。
　　2.p84介導TFF3誘導β-ARR1和Twist表達上調，β-ARR1調節(jié)TFF3激活磷酸化p84核質穿梭，激酶激活型p84入核促進Twist出核。
　　3.TFF3-p84上調組蛋白H3表達并磷酸化H3-Serl0位點。
　　4.p84-Twist介導TFF3促進IEC發(fā)生EMT相關的遷移。
　　5.磷酸化p84與TFF3在結腸癌組織中的表達呈正相關。磷酸化p84與腫瘤

10、的組織學分型、是否發(fā)生轉移及癌的原發(fā)灶和轉移灶相關。
　　6.磷酸化p84與Twist陽性表達在不同組織學分型的結腸癌中具有相關性，Twist胞質表達與結腸癌轉移具有相關性。
　　結論：
　　1.β-ARR1介導TFF3誘導的p84-Twist復合物形成，且增強p84與Twist互作;磷酸化p84入核，調控TFF3誘導的Twist核質穿梭。
　　2.p84介導TFF3-Twist調控結腸癌細胞發(fā)生EMT，并促進遷