NDRG2參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞分化的機制研究.pdf

1、人NDRG2(N-mycdownstreamregulatedgene2)基因是本研究組用錨定引物PCR方法從正常人腦cDNA文庫中克隆得到的一個新基因，基因庫登錄號為AF159092。NDRG2為NDRG基因家族成員之一，該家族成員有4個：NDRG1,NDRG2,NDRG3和NDRG4，且該基因家族成員的氨基酸組成在從低等生物到高等生物的進化中相當?shù)谋Ｊ?，提示該基因家族在細胞的生命過程起著重要作用。本研究組研究表明該基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)

2、：大腦灰質(zhì)、白質(zhì)和神經(jīng)核中均有較高水平表達，在與神經(jīng)細胞同屬終末分化細胞的唾液腺上皮細胞和骨骼肌細胞中亦有較高表達，而在具有分裂能力的骨髓干細胞和精原細胞表達量很低；在胚胎的腦、心、肝、腎、肺等臟器的表達水平也顯著低于成人相應(yīng)器官；NDRG2在腦膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等腫瘤組織及其正常組織中表達存在顯著差異。這些結(jié)果表明NDRG2表達狀態(tài)具有與細胞的增殖能力呈負相關(guān)的特點。
　　張健等誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞系Caco-2、HT-

3、29分化，檢測發(fā)現(xiàn)c-MYC在細胞分化后表達降低，而NDRG2表達則增加，這一現(xiàn)象提示NDRG2及c-MYC參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞增殖、分化，但詳細機制仍未明確。本實驗?zāi)康模焊由钊胙芯縉DRG2及c-MYC參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞分化的詳細機制。
　　我們首先購買了兩張結(jié)腸癌組織芯片，共150點，行免疫組織化Ndrg2染色，結(jié)合相關(guān)患者基本信息，經(jīng)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)在不同分化級別的結(jié)腸癌組織中Ndrg2的表達在存在顯著性差異（P=0.005）

4、。而Ndrg2的表達與患者的年齡、性別、侵潤深度和Dukes’分期等無顯著差異（P＞0.005）。
　　基于在不同分化級別的結(jié)腸癌組織中Ndrg2的表達在存在顯著性差異這一結(jié)果，我們決定行臨床樣本分析，經(jīng)統(tǒng)計教研室協(xié)助設(shè)計有效檢驗效率（power=0.75），顯著性差異設(shè)定為0.05，由專業(yè)統(tǒng)計軟件statistics6.0得出每組最小樣本量為（size=70），因本研究涉及結(jié)腸癌共分高、中、低分化三組，故總樣本量為210例。我們

5、經(jīng)2005年10月-2007年9月共收集結(jié)腸癌組織標本213例，每例患者均按正常組織、癌旁組織及癌組織收集標本，分別行免疫組織化學(xué)、蛋白印記以及Realtime-PCR分析NDRG2和c-MYC的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蛋白及基因水平NDRG2的表達隨著結(jié)腸癌分化的成熟而遞增，而c-MYC的表達隨著結(jié)腸癌分化成熟而遞減。同時在各例患者癌、癌旁及正常對照中，我們發(fā)現(xiàn)有136例NDRG2表達有遞增趨勢；而151例c-MYC有遞減趨勢。
　

6、　我們在組織水平已經(jīng)明確了NDRG2及c-MYC參與調(diào)控結(jié)腸癌的分化，但在細胞水平尚無證據(jù)，為明確NDRG2及c-MYC在結(jié)腸癌細胞分化進程中的表達情況，我們同時采用丁酸鈉誘導(dǎo)細胞系HT29、SW480、SW620分化成熟，應(yīng)用堿性磷酸酶及透射電鏡分別在酶學(xué)及組織形態(tài)學(xué)上評估結(jié)腸癌的分化程度，收取結(jié)腸癌細胞分化成熟后0、1、2、3、4、5、6d的細胞樣品，提取RNA及蛋白分別檢測NDRG2和c-MYC的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這三株結(jié)腸癌細

7、胞系中隨著細胞的分化成熟NDRG2的表達遞增，而c-MYC有遞減。
　　在組織及細胞水平我們均已證實NDRG2和c-MYC參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖與分化，但是NDRG2是啟動結(jié)腸癌細胞分化的始動因素，還是結(jié)腸癌細胞分化后的表象，我們依然未知。因此我們設(shè)計NDRG2小干擾RNA，評估結(jié)腸癌細胞系HT29分化經(jīng)NDRG2小干擾RNA后，其分化進程有無影響。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將化學(xué)合成NDRG2siRNA，controlsiRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)

8、腸癌細胞HT-29，經(jīng)Western-blot鑒定轉(zhuǎn)染成功后，加入丁酸鈉誘導(dǎo)HT29細胞分化，以量化堿性磷酸酶值（AKP）評定分化程度，通過比較轉(zhuǎn)染NDRG2siRNA和controlsiRNA的AKP值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDRG2siRNA組AKP值增長幅度顯著低于controlsiRNA（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、大樣本結(jié)腸癌病例分析發(fā)現(xiàn)NDRG2在分化高的腫瘤組織中表達顯著高于分化低的腫瘤組織，且癌組織中的表達顯著