NDRG2參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、人NDRG2(N-mycdownstreamregulatedgene2)基因是本研究組用錨定引物PCR方法從正常人腦cDNA文庫(kù)中克隆得到的一個(gè)新基因，基因庫(kù)登錄號(hào)為AF159092。NDRG2為NDRG基因家族成員之一，該家族成員有4個(gè)：NDRG1,NDRG2,NDRG3和NDRG4，且該基因家族成員的氨基酸組成在從低等生物到高等生物的進(jìn)化中相當(dāng)?shù)谋Ｊ?，提示該基因家族在?xì)胞的生命過(guò)程起著重要作用。本研究組研究表明該基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)

2、：大腦灰質(zhì)、白質(zhì)和神經(jīng)核中均有較高水平表達(dá)，在與神經(jīng)細(xì)胞同屬終末分化細(xì)胞的唾液腺上皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中亦有較高表達(dá)，而在具有分裂能力的骨髓干細(xì)胞和精原細(xì)胞表達(dá)量很低；在胚胎的腦、心、肝、腎、肺等臟器的表達(dá)水平也顯著低于成人相應(yīng)器官；NDRG2在腦膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等腫瘤組織及其正常組織中表達(dá)存在顯著差異。這些結(jié)果表明NDRG2表達(dá)狀態(tài)具有與細(xì)胞的增殖能力呈負(fù)相關(guān)的特點(diǎn)。
　　張健等誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2、HT-

3、29分化，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)c-MYC在細(xì)胞分化后表達(dá)降低，而NDRG2表達(dá)則增加，這一現(xiàn)象提示NDRG2及c-MYC參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、分化，但詳細(xì)機(jī)制仍未明確。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康模焊由钊胙芯縉DRG2及c-MYC參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞分化的詳細(xì)機(jī)制。
　　我們首先購(gòu)買了兩張結(jié)腸癌組織芯片，共150點(diǎn)，行免疫組織化Ndrg2染色，結(jié)合相關(guān)患者基本信息，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)在不同分化級(jí)別的結(jié)腸癌組織中Ndrg2的表達(dá)在存在顯著性差異（P=0.005）

4、。而Ndrg2的表達(dá)與患者的年齡、性別、侵潤(rùn)深度和Dukes’分期等無(wú)顯著差異（P＞0.005）。
　　基于在不同分化級(jí)別的結(jié)腸癌組織中Ndrg2的表達(dá)在存在顯著性差異這一結(jié)果，我們決定行臨床樣本分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)教研室協(xié)助設(shè)計(jì)有效檢驗(yàn)效率（power=0.75），顯著性差異設(shè)定為0.05，由專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件statistics6.0得出每組最小樣本量為（size=70），因本研究涉及結(jié)腸癌共分高、中、低分化三組，故總樣本量為210例。我們

5、經(jīng)2005年10月-2007年9月共收集結(jié)腸癌組織標(biāo)本213例，每例患者均按正常組織、癌旁組織及癌組織收集標(biāo)本，分別行免疫組織化學(xué)、蛋白印記以及Realtime-PCR分析NDRG2和c-MYC的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蛋白及基因水平NDRG2的表達(dá)隨著結(jié)腸癌分化的成熟而遞增，而c-MYC的表達(dá)隨著結(jié)腸癌分化成熟而遞減。同時(shí)在各例患者癌、癌旁及正常對(duì)照中，我們發(fā)現(xiàn)有136例NDRG2表達(dá)有遞增趨勢(shì)；而151例c-MYC有遞減趨勢(shì)。
　

6、　我們?cè)诮M織水平已經(jīng)明確了NDRG2及c-MYC參與調(diào)控結(jié)腸癌的分化，但在細(xì)胞水平尚無(wú)證據(jù)，為明確NDRG2及c-MYC在結(jié)腸癌細(xì)胞分化進(jìn)程中的表達(dá)情況，我們同時(shí)采用丁酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞系HT29、SW480、SW620分化成熟，應(yīng)用堿性磷酸酶及透射電鏡分別在酶學(xué)及組織形態(tài)學(xué)上評(píng)估結(jié)腸癌的分化程度，收取結(jié)腸癌細(xì)胞分化成熟后0、1、2、3、4、5、6d的細(xì)胞樣品，提取RNA及蛋白分別檢測(cè)NDRG2和c-MYC的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這三株結(jié)腸癌細(xì)

7、胞系中隨著細(xì)胞的分化成熟NDRG2的表達(dá)遞增，而c-MYC有遞減。
　　在組織及細(xì)胞水平我們均已證實(shí)NDRG2和c-MYC參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖與分化，但是NDRG2是啟動(dòng)結(jié)腸癌細(xì)胞分化的始動(dòng)因素，還是結(jié)腸癌細(xì)胞分化后的表象，我們依然未知。因此我們?cè)O(shè)計(jì)NDRG2小干擾RNA，評(píng)估結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29分化經(jīng)NDRG2小干擾RNA后，其分化進(jìn)程有無(wú)影響。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將化學(xué)合成NDRG2siRNA，controlsiRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)

8、腸癌細(xì)胞HT-29，經(jīng)Western-blot鑒定轉(zhuǎn)染成功后，加入丁酸鈉誘導(dǎo)HT29細(xì)胞分化，以量化堿性磷酸酶值（AKP）評(píng)定分化程度，通過(guò)比較轉(zhuǎn)染NDRG2siRNA和controlsiRNA的AKP值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDRG2siRNA組AKP值增長(zhǎng)幅度顯著低于controlsiRNA（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、大樣本結(jié)腸癌病例分析發(fā)現(xiàn)NDRG2在分化高的腫瘤組織中表達(dá)顯著高于分化低的腫瘤組織，且癌組織中的表達(dá)顯著