光化學(xué)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、盡管腫瘤基因治療研究取得了極大進(jìn)展，目前仍存在著大量難題亟待解決，特別在基因傳送手段與基因治療靶點(diǎn)的有效性與特異性方面。本研究著眼于探討這兩方面問(wèn)題，擬分別通過(guò)對(duì)光化學(xué)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)和誘導(dǎo)分化靶點(diǎn)的研究，對(duì)腫瘤基因治療手段與靶點(diǎn)這兩個(gè)問(wèn)題的解決做一些有意義的嘗試。 多數(shù)基因載體是以胞吞形式進(jìn)入靶細(xì)胞的。而大多數(shù)基因載體被靶細(xì)胞胞吞后只能滯留在內(nèi)吞泡中，只有少數(shù)能從內(nèi)吞泡中逸出進(jìn)入胞漿，極大影響了轉(zhuǎn)染效率，難以達(dá)到預(yù)期目的。光化學(xué)基

2、因轉(zhuǎn)染((photochemicalgenetransfection,PCGT)是一種源于光動(dòng)力治療(photodynamictherapy,PDT)原理，基于光化學(xué)作用的新型基因轉(zhuǎn)染方法，它充分利用了光敏劑在光照激發(fā)下產(chǎn)生的生物效應(yīng)，來(lái)解決常規(guī)基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)吞釋放問(wèn)題。本研究動(dòng)態(tài)觀察了光化學(xué)作用對(duì)胞吞大分子的內(nèi)吞釋放效應(yīng)，同時(shí)對(duì)不同基因載體進(jìn)行對(duì)比性PCGT研究，觀察光照劑量、光敏劑種類、不同細(xì)胞系等多個(gè)光化學(xué)作用的關(guān)鍵因素對(duì)PCGT效

3、率的影響，以期掌握PCGT的一些基本技術(shù)特性，從而達(dá)到優(yōu)化技術(shù)并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究的目的。 腫瘤細(xì)胞分化狀態(tài)對(duì)光敏劑的胞內(nèi)聚集及對(duì)PDT的影響目前不清楚。本研究通過(guò)使用丁酸鈉(sodiumbutyrate,NaBt)及全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞，對(duì)比觀察誘導(dǎo)分化對(duì)不同光敏劑的胞內(nèi)攝取及對(duì)PDT的影響，觀察誘導(dǎo)分化療法(differentiationtherapy,DT)與PDT

4、的聯(lián)合增效增效機(jī)制。 與常規(guī)抗癌治療相比，具有糾正基因表達(dá)異常、逆轉(zhuǎn)腫瘤增殖特性的誘導(dǎo)分化療法是腫瘤基因治療的另一個(gè)重要研究方向，尋找誘導(dǎo)分化基因靶點(diǎn)則是治療的關(guān)鍵。pp32是組蛋白乙?；种茝?fù)合物(inhibitorofhistoneacetyltransferase，INHAT)的關(guān)鍵亞單位，目前研究表明它與正常細(xì)胞生長(zhǎng)分化及腫瘤的發(fā)生、分化狀態(tài)密切相關(guān)。pp32可能與INHAT的另一個(gè)亞單位SET通過(guò)聯(lián)合表達(dá)來(lái)提供一種協(xié)調(diào)

5、和控制機(jī)制，來(lái)控制細(xì)胞增殖和分化。pp32也可通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白HuR作用而來(lái)調(diào)節(jié)整合包括mRNA運(yùn)輸及mRNA穩(wěn)定性的核信號(hào)通路。本課題通過(guò)檢測(cè)臨床結(jié)直腸腫瘤標(biāo)本pp32、SET、HuR的表達(dá)與臨床病理聯(lián)系，并使用NaBt及ATRA誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞分化，觀察pp32與結(jié)直腸腫瘤分化及組蛋白乙酰化的關(guān)系，進(jìn)而通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制pp32表達(dá)，觀察其對(duì)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞分化及增殖的影響。 方法：本研究以人結(jié)腸癌HT29及SW480細(xì)胞

6、系為研究對(duì)象，進(jìn)行了以下3部分研究：1、利用激光共聚焦顯微鏡(laserconfocalscanningmicroscopy,LCSM)觀察了δ一氨基乙酰丙酸(δ-aminolevulinateacid,ALA)、氨基乙酰丙酸甲酯(aminolevulinateacidhexylester,ALA-HE)、血卟啉單甲醚(hematoporphyrinmonomethylether,HMME)、中介四-(對(duì)苯基磺酸)-卟吩鈉(meso-t

7、etraphenylporphinedisulfonate,TPPS2a)4種光敏劑的細(xì)胞內(nèi)分布特點(diǎn)。MTT法檢測(cè)了這4種光敏劑對(duì)HT29和SW480細(xì)胞的光化學(xué)細(xì)胞毒性及劑量評(píng)估。在LCSM下利用內(nèi)吞標(biāo)志物FITC-dextran動(dòng)態(tài)觀察了腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞體形成及光化學(xué)作用對(duì)內(nèi)吞體的胞內(nèi)釋放作用。以陽(yáng)離子聚合物聚乙烯基亞胺(polyetheneimine,PEI)為基因載體，以攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluores

8、ceinprotein,EGFP)基因的表達(dá)載體pEGFP-C1質(zhì)粒為觀察對(duì)象，通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察了光化學(xué)作用對(duì)PEI介導(dǎo)增強(qiáng)pEGFP-C1轉(zhuǎn)染效率的影響。2、使用NaBt及ATRA誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞，分別應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性測(cè)定來(lái)觀察NaBt、ATRA對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。通過(guò)LCSM對(duì)比觀察誘導(dǎo)分化結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)ALA及TPPS2a的攝取，MTT實(shí)驗(yàn)觀察

9、誘導(dǎo)分化對(duì)這2種光敏劑光動(dòng)力反應(yīng)的影響。3、利用免疫組化及免疫熒光技術(shù)觀察了pp32、SET、HuR在結(jié)腸癌細(xì)胞、臨床結(jié)直腸良惡性組織中的表達(dá)，分析了pp32、SET、HuR與結(jié)直腸腫瘤臨床病理因素的相關(guān)性；利用NaBt、ATRA誘導(dǎo)SW480細(xì)胞分化，通過(guò)RT-PCR和蛋白印跡技術(shù)對(duì)比觀察分化前后pp32、SET、HuR，ERK、JNK、p38MAPK信號(hào)通路的變化。使用RNA干擾技術(shù)抑制pp32表達(dá)，通過(guò)形態(tài)學(xué)、MTT實(shí)驗(yàn)、ALP活

10、性測(cè)定觀察對(duì)SW480細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，RT-PCR和蛋白印跡技術(shù)觀察了抑制pp32表達(dá)對(duì)SET、HuR、Rb磷酸化及ERK、JNK、p38MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。 結(jié)果： 1.ALA、ALA-HE、HMME、TPPS2a4種光敏劑因其不同的物理化學(xué)性質(zhì)而在胞內(nèi)分布中有不同的特點(diǎn)。TPPS2a為典型的胞漿內(nèi)顆粒狀熒光分布，HMME為顆粒狀熒光與胞漿內(nèi)彌散熒光同時(shí)存在，ALA、ALA-HE主要表現(xiàn)為胞漿內(nèi)的彌散性分布。

11、 2.基于ALA、ALA-HE、HMME、TPPS2a4種光敏劑的PDT作用對(duì)SW480和HT29細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有明顯抑制作用，抑制作用呈劑量依賴性，與各對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)；在同一光照劑量下，SW480細(xì)胞較HT29細(xì)胞對(duì)光化學(xué)毒性作用更加敏感，在相同光敏劑濃度下，SW480細(xì)胞取得IC50的光照時(shí)間低于HT29。 3.TPPS2a、HMME與細(xì)胞內(nèi)吞密切相關(guān)；基于TPPS2a、HMME的光化學(xué)作用可表現(xiàn)出明

12、顯的內(nèi)吞釋放效應(yīng)，ALA、ALA—HE則對(duì)內(nèi)吞熒光大分子無(wú)明顯釋放作用。 4.與單純PEI介導(dǎo)pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HT29及SW480細(xì)胞相比，基于光敏劑TPPS2a及HMME的光化學(xué)作用可明顯增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染(P＜0.05)。而ALA及ALA-HE無(wú)明顯增強(qiáng)作用。在一定光照劑量范圍內(nèi)，隨著光照劑量的增加，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染率呈上升趨勢(shì)，而隨著光照劑量的進(jìn)一步增大，細(xì)胞存活率明顯下降；在達(dá)到30-50％細(xì)胞抑制率的光照劑

13、量，PCGT可取得較高的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞存活率；在同一轉(zhuǎn)染條件下，SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高于HT29細(xì)胞。 5.SW480細(xì)胞在ATRA或NaBt誘導(dǎo)下可發(fā)生成纖維細(xì)胞樣變化，不同濃度組ATRA(1μM、5μM、10μM)及NaBt(2.5mM、5mM、10mM)均對(duì)SW480細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用(P＜0.05)，抑制效應(yīng)呈劑量依賴性。與對(duì)照組比較，在NaBt或ATRA誘導(dǎo)下，SW480細(xì)胞ALP活性都有不同程度的明顯升高(

14、P＜0.05)，且呈藥物劑量依賴性。在ATRA(5μM)及NaBt(5mM)處理48h后，SW480細(xì)胞周期明顯阻滯,G0/G1期比例顯著增加，S期和G2/M期比例明顯下降。 6.與對(duì)照組比較，在ATRA和NaBt作用下，隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的逐步延長(zhǎng)，ALA在SW480細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的PpⅨ熒光強(qiáng)度逐漸下降；與之相反，TPPS2a在SW480細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度逐漸升高。 7.NaBt誘導(dǎo)分化可明顯增強(qiáng)TPPS2a-PDT對(duì)S

15、W480細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，細(xì)胞對(duì)光動(dòng)力作用敏感性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，達(dá)到IC50光照時(shí)間由12.99±0.89min降低到7.22±2.59min；而NaBt誘導(dǎo)分化對(duì)ALA-PDT的細(xì)胞殺傷效應(yīng)無(wú)明顯影響。 結(jié)論： 1.PCGT可有效增強(qiáng)陽(yáng)離子聚合物PEI介導(dǎo)表達(dá)EGFP基因的轉(zhuǎn)染。PCGT的有效轉(zhuǎn)染依賴于多個(gè)條件：1)具有內(nèi)吞釋放特性的光敏劑是PCGT技術(shù)的基礎(chǔ)，這種特性與光敏劑的胞內(nèi)分布有關(guān)，內(nèi)吞釋放機(jī)制是

16、PCGT的關(guān)鍵機(jī)制；2)靶細(xì)胞的光動(dòng)力敏感性是PCGT的必要條件，而摸索該細(xì)胞系對(duì)光敏劑的劑量效應(yīng)關(guān)系是優(yōu)化PCGT所需光照劑量的保證；3)PCGT技術(shù)仍需要合適的基因載體，單純的光化學(xué)效應(yīng)沒(méi)有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的作用。 2.NaBt和ATRA可有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞分化；腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)可對(duì)PDT細(xì)胞毒性作用產(chǎn)生明顯影響，這種作用與細(xì)胞分化狀態(tài)對(duì)光敏劑胞內(nèi)聚集的影響有關(guān)。在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，ALA代謝產(chǎn)生的PpⅨ胞內(nèi)聚集下降，

17、DT對(duì)ALA-PDT的光動(dòng)力殺傷效應(yīng)沒(méi)有影響；TPPS2a的胞內(nèi)聚集明顯增加；DT可明顯增強(qiáng)TPPS2a-PDT的光動(dòng)力殺傷作用。 3.pp32的表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸腫瘤分化程度密切相關(guān)，與患者性別、腫瘤位置、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等均無(wú)明顯相關(guān)性。HuR的胞漿表達(dá)模式與結(jié)直腸腫瘤分化有密切關(guān)系。 4.誘導(dǎo)分化中pp32表達(dá)下降與組蛋白乙酰化調(diào)節(jié)有關(guān)；NaBt抑制HuR蛋白的核輸出，使其滯留在核內(nèi)；NaBt及ATRA