ALA-PDT結(jié)合DPC4基因轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響.pdf

1、研究背景及目的： 大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在消化道腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均位居第二位。隨著人們生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)的變化，近年來大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其中以結(jié)腸癌的發(fā)病率增高為主。目前我國結(jié)腸癌的發(fā)病率已超過直腸癌，明顯改變了長期以來大腸癌中以直腸癌為主的格局。這種發(fā)病趨勢與西方發(fā)達(dá)國家結(jié)直腸癌的發(fā)病情況趨向一致。目前對大腸癌病因?qū)W的研究仍無明確定論，發(fā)病機制尚未完全闡明，手術(shù)仍是治療大腸癌最主要而有效的方法

2、，而5年生存率一直未有明顯提高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤的基因治療取得了明顯的進(jìn)展。手術(shù)為主，結(jié)合放化療、基因治療等多種方法的綜合治療已成為大腸癌治療的發(fā)展方向。 目前認(rèn)為腫瘤屬于細(xì)胞周期性疾病，細(xì)胞周期失控導(dǎo)致的細(xì)胞異常增生是腫瘤發(fā)生的一個關(guān)鍵因素。通過對腫瘤細(xì)胞的生長周期進(jìn)行調(diào)控，使其產(chǎn)生周期阻滯是抑制腫瘤細(xì)胞快速增殖，延緩腫瘤發(fā)展的一個有效方法。作為影響細(xì)胞周期進(jìn)程的最關(guān)鍵點，位于細(xì)胞周期G1、S期之間的G1/S期檢查點

3、成為干預(yù)腫瘤生長進(jìn)程的理想切入點。 光動力療法，是指光敏物質(zhì)經(jīng)特定波長的光照射形成激發(fā)態(tài)后，產(chǎn)生單態(tài)氧等多種具有細(xì)胞毒性的活性氧簇，對異常細(xì)胞和組織產(chǎn)生殺傷作用的一種治療方法。目前光動力療法對腫瘤細(xì)胞的作用機制尚不十分清楚，有研究表明光動力療法可通過阻滯腫瘤細(xì)胞周期于G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 DPC4是一種抑癌基因，它的突變或缺失與胰腺癌、家族性息肉病、大腸癌等多種腫瘤相關(guān)。腫瘤晚期發(fā)生DPC4基因突變的機率較早期有

4、明顯增高。TGF-β1對上皮源性的腫瘤具有抑制作用，而DPC4基因的產(chǎn)物Smad4蛋白是TGF-β1信號傳導(dǎo)通路的核心環(huán)節(jié)，起著將TGF-β1信號傳入核內(nèi)的作用。有研究表明，在DPC4缺失時，TGF-β1失去對胰腺癌細(xì)胞的生長抑制作用。為了對光動力療法與DPC4基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞生長的影響及其作用機制有所了解，在本實驗中，我們選用DPC4基因缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480為研究對象，對其進(jìn)行以ALA為光敏劑的光動力處理與DPC4基因轉(zhuǎn)染。利

5、用RT-PCR、Western-blotting、MTT、免疫組化、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞技術(shù)等技術(shù)手段對SW480細(xì)胞的增殖情況、細(xì)胞周期以及G0/G1期檢查點相關(guān)調(diào)控因子CDK2/4、CyclinD1/E、P21、P27進(jìn)行檢測，以期為大腸癌的治療提供一定的依據(jù)。 實驗方法和結(jié)果 第一部分：ALA-PDT對結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖抑制作用 1.ALA-PDT處理后細(xì)胞胞體縮小、變圓、細(xì)胞間接觸減少、折光

6、性減小，生長緩慢。表現(xiàn)為明顯的增殖抑制狀態(tài)。PDT后24h，細(xì)胞的增殖抑制率約為52.83％，96h達(dá)到66.58％。 2.ALA-PDT處理后處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯高于對照組(P＜0.05)，并隨時間的推移呈上升趨勢；而S期細(xì)胞比例明顯降低(P＜0.05)，且隨時間的推移呈下降趨勢。大量細(xì)胞阻滯于G0/G1期。 3.RT-PCR與Western-blotting檢測結(jié)果顯示，ALA-PDT處理后細(xì)胞周期蛋白Cy

7、clinDl/E、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2/4的mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于對照組(P＜0.05，P＜0.01)；周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05，P＜0.01)；P27表達(dá)未見明顯改變。 第二部分：DPC4基因轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480生長的影響 1.用PCR技術(shù)對Ad-hDPC4進(jìn)行鑒定。通過大量擴增并進(jìn)行純化后獲得滴度為2×1012pfu/ml的病毒液。

8、 2.用Ad-hDPC4感染SW480細(xì)胞，感染率達(dá)80％。用RT-PCR和Western-blotting技術(shù)檢測出DPC4mRNA及蛋白的表達(dá)，而對照組中未能檢出，說明目的基因已成功轉(zhuǎn)入并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。 3.轉(zhuǎn)染DPC4基因后細(xì)胞生長緩慢，增殖受到抑制。抑制率約在45-60％左右。G0/G1期的細(xì)胞比例明顯高于對照組(P＜0.05)；而S期細(xì)胞比例明顯降低(P＜0.05)。表現(xiàn)為G0/G1期阻滯。 4.轉(zhuǎn)染DPC4

9、基因后CyclinD1/E、CDK2/4的mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于對照組(P＜0.05，P＜0.01)；P21與P27的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯增高(P＜0.05，P＜0.01)。 第三部分：ALA-PDT與DPC4基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合應(yīng)用對SW480細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同作用 將ALA-PDT與DPC4基因轉(zhuǎn)染兩種方法聯(lián)合應(yīng)用后，對抑制SW480細(xì)胞的增殖有明顯的協(xié)同作用，抑制率達(dá)70％以上，增殖抑制作用明顯優(yōu)于單用其中任

10、一方法(P＜0.05，P＜0.0D；與單用其中任一方法比較，G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增高(P＜0.01)；而S期細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.01)。使大量細(xì)胞阻滯于G0/G1期。 結(jié)論 1.ALA-PDT通過誘導(dǎo)P21過表達(dá)，對CyclinD1、CyclinE及其配體CDK2、CDK4產(chǎn)生抑制，使結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480產(chǎn)生G0/G1期周期阻滯，抑制SW480細(xì)胞的增殖。 2.DPC4基因轉(zhuǎn)染能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW4