卵轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導(dǎo)HT--29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、近年來，越來越多的研究證據(jù)表明雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin，OTF)具有抗腫瘤活性，分析研究OTF抑制細(xì)胞生長的作用以及凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)來揭示其誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用具有十分重要的理論意義。
　　本課題利用醇析法并結(jié)合兩步離子交換法純化得到OTF（純度＞96.65％），并用純化的天然OTF干預(yù)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的生長;顯微鏡觀察和MTT法檢測細(xì)胞的生長狀況和細(xì)胞生長率;AnnexinⅤ-EGFP與PI雙染法檢

2、測細(xì)胞凋亡率以及JC-1染色法測定細(xì)胞線粒體膜電位;最后利用蛋白質(zhì)免疫印跡法測定線粒體途徑和死亡受體途徑中的關(guān)鍵蛋白Caspase3、Bcl-2、Bax、FADD、Caspase8以及Bid的表達(dá)，研究OTF誘導(dǎo)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用以及誘導(dǎo)凋亡的途徑。
　　卵轉(zhuǎn)鐵蛋白在濃度范圍為10mg/mL、30 mg/mL、50 mg/mL、70 mg/mL內(nèi)對(duì)于HT-29細(xì)胞具有抑制生長的影響，且隨著干預(yù)濃度的增大，細(xì)胞逐漸與周圍

3、細(xì)胞脫離并呈單個(gè)生長、貼壁性變差、細(xì)胞逐漸變小且形態(tài)逐漸干癟、顏色昏暗無光澤，尤其是70mg/mL的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白干預(yù)細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可能是由于細(xì)胞死亡后不再貼壁生長。10mg/mL、30 mg/mL、50 mg/mL、70 mg/mL濃度范圍內(nèi)的OTF對(duì)細(xì)胞生長率均有所抑制，且隨著干預(yù)濃度的增加，OTF對(duì)HT-29細(xì)胞生長的抑制作用不斷增強(qiáng)，具有很明顯的濃度依賴性;同時(shí)隨著OTF干預(yù)時(shí)間的增加(24h、36h、48h、60h)細(xì)

4、胞生長率也逐漸下降。OTF具有抑制HT-29細(xì)胞生長的作用可能與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力有關(guān)。而OTF在濃度范圍為10mg/mL、30 mg/mL、50mg/mL、70 mg/mL內(nèi)對(duì)于細(xì)胞凋亡率的影響的表明:隨著OTF干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的增加，HT-29細(xì)胞凋亡率逐漸升高，尤其是濃度為50mg/mL和70mg/mL的OTF干預(yù)細(xì)胞后，凋亡率隨著干預(yù)時(shí)間的增加（24h至60h）顯示出更加顯著的變化:50mg/mL組細(xì)胞凋亡率由1

5、506％上升至6993％，70mg/mL組細(xì)胞凋亡率由15.28％上升至84.43％。濃度范圍在10mg/mL、30 mg/mL、50 mg/mL、70 mg/mL的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分別干預(yù)HT-29細(xì)胞12h、18h和24h后，線粒體膜電位顯著下降，且具有明顯的濃度依賴性，但隨著干預(yù)時(shí)間的增加這種下降趨勢逐漸變緩，表明OTF可以誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡并且可能與線粒體途徑有關(guān)，但隨著干預(yù)時(shí)間的增加使細(xì)胞由凋亡早期階段逐漸進(jìn)入凋亡晚期階段。

6、r>　　卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可以激活處于凋亡通路下游位置的Caspase3，說明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡是通過Caspase依賴性途徑進(jìn)行的，而線粒體途徑中的Bcl-2蛋白的表達(dá)量隨著卵轉(zhuǎn)鐵蛋白干預(yù)濃度的升高不斷減少，Bax蛋白表達(dá)量隨著卵轉(zhuǎn)鐵蛋白干預(yù)濃度的升高不斷增加，表明促凋亡因子Bax與抗凋亡因子Bcl-2均被激活，即卵轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞后激活了線粒體途徑，并使下游Caspase3活化，從而引起細(xì)胞凋亡。在死亡受體途徑中，連