PAK4對結(jié)腸癌細(xì)胞糖代謝的調(diào)節(jié)及機(jī)制.pdf

1、目的:p21激活激酶（p-21 activated kinases，PAKs）是一類進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac1的下游主要靶蛋白，迄今為止PAK家族共發(fā)現(xiàn)6個(gè)成員，根據(jù)其結(jié)構(gòu)相似性，調(diào)節(jié)機(jī)制及功能將它們分為兩類，Ⅰ類包括PAK1-3，Ⅱ類包括PAK4-6。PAK4作為Ⅱ類PAK的代表性成員，在多種細(xì)胞組織中廣泛表達(dá)，參與許多重要的細(xì)胞活動(dòng)，如保護(hù)細(xì)胞抑制凋

2、亡、促進(jìn)細(xì)胞遷移和細(xì)胞錨定非依賴性生長等。并且PAK4作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮重要作用。此外，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系和惡性腫瘤組織中都存在PAK4的高表達(dá)或者遺傳性擴(kuò)增。本課題組的前期研究表明，PAK4在人胃癌組織及多種人胃癌細(xì)胞系中表達(dá)異常增高。
　　葡萄糖是正常組織細(xì)胞最重要的能源，在細(xì)胞內(nèi)有兩條主要的產(chǎn)能途徑:糖酵解和有氧氧化。正常細(xì)胞通常以有氧氧化來供能，只有在氧氣供應(yīng)不足的條件下以糖酵解供

3、能，糖酵解是一條低效的產(chǎn)能途徑，因此在正常細(xì)胞內(nèi)有氧氧化通常抑制糖酵解，稱為巴斯德效應(yīng)。大約在80年前Warburg首先發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞即使在有氧的條件下也主要依賴糖酵解供能，這是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)代謝特性被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解。糖酵解的代謝過程是將葡萄糖經(jīng)6-磷酸葡萄糖等一系列轉(zhuǎn)變最后生成乳酸。磷酸戊糖途徑是糖酵解的一個(gè)支路，是從6-磷酸葡萄糖開始經(jīng)一系列代謝轉(zhuǎn)變，又回到糖酵解途徑。該支路最重要的生理意義是產(chǎn)生兩個(gè)重要的中間產(chǎn)物

4、:還原當(dāng)量NADPH和5-磷酸核糖，NADPH在體內(nèi)用于脂酸和膽固醇等物質(zhì)的還原性合成;5-磷酸核糖是DNA和RNA合成的原料。6-磷酸葡萄糖脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是該途徑的關(guān)鍵酶，由管家基因編碼，在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、肺癌、宮頸癌中都可見到G6PD的異常表達(dá)。G6PD在NIH3T3細(xì)胞的異位表達(dá)明顯地提高了NADPH的水平，促進(jìn)了細(xì)胞錨定非依賴性生長，這些都提示

5、G6PD是一個(gè)癌基因。已有研究證實(shí)抑癌基因p53在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖代謝中發(fā)揮重要作用。
　　本研究首先采用GC-MS法篩選沉默PAK4后的差異代謝物，在蛋白相互作用的基礎(chǔ)上探討PAK4與G6PD通路之間的對話，及它們對結(jié)腸癌細(xì)胞代謝及生長的影響，為明確結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:
　　1、GST-pull down實(shí)驗(yàn)鑒定PAK4與G6PD在體外的相互作用。
　　2、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)

6、PAK4與G6PD在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　3、共聚焦激光掃描顯微鏡觀察PAK4與G6PD的定位及共定位。
　　4、NADPH試劑盒檢測PAK4對細(xì)胞內(nèi)NADPH含量的影響。
　　5、葡萄糖試劑盒檢測PAK4對葡萄糖消耗的影響。
　　6、利用Western Blot方法檢測PAK4對G6PD的蛋白表達(dá)水平的影響。
　　7、分光光度法檢測PAK4對G6PD活性的影響。
　　8、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法檢測P

7、AK4對細(xì)胞內(nèi)糖、脂及其他代謝物含量的影響。
　　9、生長曲線法檢測PAK4對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響。
　　10、利用Western Blot方法和X2檢驗(yàn)分析方法證實(shí)PAK4和G6PD在結(jié)腸癌組織樣本中存在正相關(guān)性。
　　11、免疫組織化學(xué)方法、非參數(shù)檢驗(yàn)方法和Mann-Whitney U-test分析方法證實(shí)PAK4和G6PD與結(jié)腸癌病理特征的關(guān)系。
　　12、體外激酶實(shí)驗(yàn)分析檢測PAK4對G6PD的磷酸化情況

8、。
　　13、GST-pull down實(shí)驗(yàn)鑒定PAK4與P53在體外的相互作用。
　　14、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK4與P53在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　15、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測PAK4與P53競爭和G6PD的結(jié)合。
　　16、Western Blot檢測PAK4對P53和MDM2蛋白表達(dá)水平的影響。
　　17、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK4促進(jìn)P53的泛素化降解。
　　18、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK4與

9、MDM2在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　19、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK4促進(jìn)P53和MDM2的結(jié)合。
　　20、在HCT116p53-/-細(xì)胞中采用NADPH試劑盒檢測PAK4對細(xì)胞內(nèi)NADPH含量的影響。
　　21、在HCT116p53-/-細(xì)胞中采用葡萄糖試劑盒檢測PAK4對葡萄糖消耗的影響。
　　結(jié)果:
　　1、PAK4與G6PD能夠在體外直接結(jié)合。
　　2、PAK4與G6PD能夠在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT1

10、16 p53+/+內(nèi)相互作用。
　　3、PAK4與G6PD能夠在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 p53+/+細(xì)胞質(zhì)中共定位。
　　4、在HCT116p53+/+細(xì)胞中PAK4促進(jìn)了NADPH的生成。
　　5、在HCT116p53+/+細(xì)胞中PAK4促進(jìn)了葡萄糖的消耗。
　　6、在HCT116p53+/+細(xì)胞中PAK4對G6PD的蛋白表達(dá)水平幾乎沒有影響。
　　7、在HCT116p53+/+細(xì)胞中PAK4提高了G6P

11、D的活性。
　　8、在HCT116p53+/+細(xì)胞中PAK4促進(jìn)了軟脂酸、膽固醇、各種氨基酸及其他代謝物的生成。
　　9、在HCT116p53+/+細(xì)胞中，PAK4促進(jìn)了細(xì)胞的生長。
　　10、PAK4和G6PD在結(jié)腸癌組織中的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。
　　11、PAK4和G6PD與結(jié)腸癌的TNM分期密切相關(guān)。
　　12、PAK4不能磷酸化G6PD.
　　13、PAK4與P53能夠在體外直接結(jié)合。
　

12、　14、PAK4與P53能夠在HCT116 p53+/+細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。
　　15、PAK4不影響P53和G6PD的結(jié)合。
　　16、在HCT116p53+/+中PAK4下調(diào)p53的蛋白表達(dá)水平。
　　17、在HCT116p53+/+中PAK4促進(jìn)了p53的泛素化降解。
　　18、PAK4與泛素蛋白連接酶E3(MDM2)能夠在HCT116 p53+/+細(xì)胞內(nèi)相互作用。
　　19、PAK4上調(diào)泛素蛋白連接

13、酶E3(MDM2)的表達(dá)。
　　20、PAK4促進(jìn)E3泛素連接酶(MDM2)與P53的結(jié)合。
　　21、在HCT116p53-/-細(xì)胞中PAK4對NADPH的生成沒有明顯影響
　　22、在HCT116p53-/-細(xì)胞中PAK4對葡萄糖的消耗沒有明顯影響。
　　結(jié)論:1、PAK4促進(jìn)了結(jié)腸癌HCT116p53+/+細(xì)胞葡萄糖的消耗，NADPH的生成，提高了G6PD的活性，促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的脂肪酸、膽固醇和其他代謝物