花生凝集素介導(dǎo)的結(jié)腸癌靶向給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、結(jié)腸癌是胃腸道常見腫瘤。放療對(duì)結(jié)腸癌敏感性較差及小腸毒副作用明顯。常規(guī)化療時(shí)，由于抗腫瘤藥物通常缺乏區(qū)分正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞的選擇性，容易引起全身的毒副作用、降低患者對(duì)治療的耐受性。腫瘤靶向治療有望將抗腫瘤藥物選擇性地集中在腫瘤組織，而沒有臨床上區(qū)域動(dòng)脈灌注所帶來的手術(shù)痛苦和風(fēng)險(xiǎn)，因而是較好的替代方法。目前，腫瘤靶向治療最大的障礙是缺乏合適的具有特殊識(shí)別能力的藥物載體。尋找選擇性強(qiáng)、能夠有效載帶抗腫瘤藥物的靶向載體，并考察其在體內(nèi)的靶

2、向性及在腫瘤模型中的活性，是靶向治療研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。 近年來，凝集素在腫瘤研究中的應(yīng)用受到了越來越廣泛的關(guān)注。人體細(xì)胞膜含有豐富的糖蛋白和糖脂，其中糖類部分的單糖和寡糖可與凝集素發(fā)生特異性的親和結(jié)合，不同細(xì)胞的受體由于所含糖的結(jié)構(gòu)不同，只能與特定的凝集素結(jié)合，從而使凝集素具有“識(shí)別”某種細(xì)胞的能力。而且，某些腫瘤細(xì)胞存在著特異性的凝集素受體。此外，凝集素?zé)o免疫源性、與單糖及糖復(fù)合物中的糖結(jié)構(gòu)部分的識(shí)別具有高度特異性、具有多價(jià)結(jié)

3、合能力并且結(jié)合了某些藥物、毒性蛋白、放射性同位素后其活性保持不變。因此，凝集素在腫瘤的靶向治療中有著極好的應(yīng)用前景。將抗腫瘤藥物與凝集素偶聯(lián)，選擇合適的凝集素或許可以控制細(xì)胞對(duì)偶聯(lián)物的攝取和其在細(xì)胞內(nèi)的傳遞途徑，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤治療真正意義上的細(xì)胞靶向。但目前，有關(guān)其在腫瘤靶向治療中的作用的研究尚在起步階段。 花生凝集素(PNA)是從花生中提取并純化的一種蛋白質(zhì)，具有如下主要特點(diǎn)：1)不凝集正常的淋巴細(xì)胞和血液細(xì)胞，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞

4、；2)花生凝集素是種子植物的組成成分，亦是人常常食用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，無明顯毒副作用；3)對(duì)酸性環(huán)境和多種酶有較好抗性；4)具有多價(jià)結(jié)合能力；5)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞上PNA受體與正常組織之間存在顯著性差異，在大量癌變的結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上和細(xì)胞的頂端胞漿內(nèi)出現(xiàn)了PNA結(jié)合位點(diǎn)。以上特點(diǎn)說明PNA具有作為抗腫瘤藥物載體用于腫瘤靶向治療的可能性。 本課題選擇治療胃腸道腫瘤的一線藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為模型藥物，以在胃腸道腫瘤有高表達(dá)

5、受體的花生凝集素為靶向載體，通過EDC/NHS一步法制備出可口服給藥的5-Fu-PNA前體偶聯(lián)物。綜合考察了該偶聯(lián)物的制備工藝、特異單糖對(duì)凝集素生物活性的保護(hù)作用和體外穩(wěn)定性以及偶聯(lián)物的電泳性質(zhì)。采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡，以人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和人正常肝細(xì)胞Chang作為代表性細(xì)胞模型，通過模型細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化對(duì)偶聯(lián)物的細(xì)胞作用機(jī)制進(jìn)行探討。并采用MTT法考察該偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性、特異性和選擇性。從而在體外對(duì)PNA為載體的腫瘤細(xì)胞主動(dòng)

6、靶向給藥系統(tǒng)的可行性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。該研究未見報(bào)道。本研究將豐富靶向給藥系統(tǒng)的研究?jī)?nèi)容和科學(xué)基礎(chǔ)，為靶向給藥系統(tǒng)的研究提供一個(gè)新的領(lǐng)域。 本研究首先進(jìn)行了5-氟尿嘧啶-花生凝集素偶聯(lián)物(5-Fu-PNA)的制備研究。偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，如何保護(hù)蛋白質(zhì)不變性，實(shí)現(xiàn)藥物與凝集素載體的偶聯(lián)，避免凝集素的自身交聯(lián)，保留凝集素的生物活性同時(shí)得到較高的藥物連接率，是本試驗(yàn)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。采用蛋白質(zhì)常用的修飾方法EDC法制備時(shí)，需要先進(jìn)行羧基的活化，

7、但由于5-Fu不含羧基，只有選擇凝集素先進(jìn)行活化。但凝集素本身也含有氨基基團(tuán)，活化的同時(shí)就可能導(dǎo)致凝集素的自身交聯(lián)，從而使得偶連物的載藥量降低、生物活性丟失、后續(xù)的藥效學(xué)藥理學(xué)評(píng)價(jià)無法進(jìn)行。因此，本試驗(yàn)選擇了將5-Fu進(jìn)行衍生化，得到了1-N-羧基取代5-Fu，并采用EDC/NHS法對(duì)1-N-羧基取代5-Fu進(jìn)行活化，形成具有較高穩(wěn)定性的活性酯。再采用D-半乳糖保護(hù)凝集素活性中心的方法，將活性酯與花生凝集素PNA連接，得到藥物與載體的酰

8、胺鍵共價(jià)偶聯(lián)物。 以C57小鼠胸腺細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)偶連物生物活性，建立了TNBS法測(cè)定藥物連接率。并以生物活性和藥物連接率為指標(biāo)考察了1-N-乙酸取代5-Fu、EDC與NHS三者摩爾比、12h和24h的連接反應(yīng)時(shí)間、D-半乳糖(D-gal)加入量對(duì)偶連物連接的影響。結(jié)果表明，1-N-乙酸取代5-Fu、EDC與NHS三者摩爾比為1：5：2，連接反應(yīng)時(shí)間為12h，D-半乳糖(D-gal)加入量為PNA的2.5倍以上時(shí)，可制得藥物連

9、接率38.42％、凝集活性完全保留的偶連物。達(dá)到了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的。此外，對(duì)偶連物的性質(zhì)和體外穩(wěn)定性也進(jìn)行了考察。偶連物在SDS-PAGE圖上出現(xiàn)了新的分子量增大約3kD的條帶。4℃放置一個(gè)月以上，凝集活性基本不變，可保持在85％以上。偶連物在人工腸液、37℃條件下，6h以內(nèi)活性不下降，可保持在95％以上。但在人工胃液、37℃條件下，5min時(shí)偶連物已經(jīng)完全降解。因此，可考慮將偶連物制成供口服的結(jié)腸制劑。 采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡

10、對(duì)5-氟尿嘧啶-花生凝集素偶聯(lián)物與靶細(xì)胞LoVo和非靶細(xì)胞Chang的結(jié)合特點(diǎn)與內(nèi)化機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，5-Fu-PNA可與靶細(xì)胞LoVo發(fā)生特異性粘附，可被花生凝集素特異的單糖抑制。這種特異性粘附具有濃度依賴性，低濃度時(shí)靶細(xì)胞的熒光強(qiáng)度低于高濃度時(shí)的熒光強(qiáng)度。這種特異性粘附還具有溫度依賴性，4℃時(shí)靶細(xì)胞的熒光強(qiáng)度高于37℃時(shí)，提示偶連物可能被細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)入胞內(nèi)。與此相反，5-Fu-PNA幾乎不能結(jié)合非靶細(xì)胞Chang。證實(shí)了凝集素

11、介導(dǎo)的偶連物對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的主動(dòng)識(shí)別和選擇作用。 采用MTT試驗(yàn)法評(píng)價(jià)了偶連物的細(xì)胞毒作用及特點(diǎn)，主要包括：1)5-Fu-PNA對(duì)靶細(xì)胞LoVo的細(xì)胞毒作用與游離藥物一樣，呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性；2)與游離藥物相比，偶連物的作用時(shí)間滯后于游離藥物。當(dāng)5-Fu的濃度為8μM時(shí)，游離藥物殺死全部細(xì)胞需要96h，而偶連物需要120h，提示5-Fu-PNA在體內(nèi)可能具有緩釋效果；3)無活性偶連物和游離PNA對(duì)靶細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。

12、 表現(xiàn)為在60μg/ml的高濃度下、48h的作用時(shí)間時(shí)，無活性偶連物和游離PNA組細(xì)胞存活率維持在90％以上，而活性偶連物組細(xì)胞存活率僅為48.41％，提示偶連物的細(xì)胞毒作用是特異性的；4)與對(duì)靶細(xì)胞LoVo的細(xì)胞毒作用相反，5-Fu-PNA對(duì)非靶細(xì)胞幾乎沒有細(xì)胞毒作用，而游離藥物對(duì)Chang細(xì)胞的作用與對(duì)LoVo細(xì)胞的作用是一致的。又一次證實(shí)了偶連物具有選擇性識(shí)別靶細(xì)胞的能力，其細(xì)胞毒作用是選擇性的。提示在體內(nèi)給藥時(shí)，偶連物可能