β-catenin靶向siRNA抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、目的；Wnt/β-catenin信號(hào)通路是研究得比較清楚的Wnt信號(hào)通路，通常被稱(chēng)為Wnt正規(guī)通路，該通路的激活與結(jié)腸癌的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其關(guān)鍵成分是β-catenin。正常情況下β-catenin依賴(lài)由GSK-3β、APC蛋白和Axin蛋白所形成的復(fù)合物磷酸化而降解，使胞漿中游離的β-catenin維持在極低水平，這對(duì)于Wnt信號(hào)通路的正常傳導(dǎo)以及E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附都具有重要作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，絕大

2、多數(shù)結(jié)腸癌中存在APC基因的突變，突變的APC蛋白發(fā)生了“去頂”改變，導(dǎo)致β-catenin的降解障礙，引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的積聚，進(jìn)而穿梭入核與Tcf-4/Lef結(jié)合，啟動(dòng)靶基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖、惡性轉(zhuǎn)型及細(xì)胞間黏附功能的下降，促使結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)，一種稱(chēng)作RNAi(RNAinterfering)的技術(shù)被成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該技術(shù)可通過(guò)退火的雙鏈siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞以高效而特異性地下調(diào)細(xì)胞內(nèi)特定基因的

3、表達(dá)。在本研究中，我們應(yīng)用靶向β-catenin的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞系，具有高轉(zhuǎn)移特性，已知其APC基因已發(fā)生突變，細(xì)胞內(nèi)存在β-catenin的異常表達(dá))，擬通過(guò)RNAi技術(shù)抑制細(xì)胞中CTNNB1(β-catenin編碼基因)基因的表達(dá)，以研究下調(diào)β-catenin水平后對(duì)LoVo細(xì)胞中E-cadherin、MMP7、CD44v6表達(dá)的影響以及LoVo細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，為下一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)，

4、最終為結(jié)腸癌的臨床治療尋找有效的作用靶點(diǎn)。 材料與方法；消化收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞，接種于6孔板。待其貼壁生長(zhǎng)達(dá)80％～95％匯合時(shí)，將合成的靶向β-catenin編碼基因mRNA的siRNA(長(zhǎng)度21-mer，序列為：sense：5'-AGCUGAUAUUGAUGGACAGdTdT-3'，antisense∶5'-CUGUCCAUCAAUAUCAGCdTdT-3’,其sense鏈5'端標(biāo)記綠色熒光蛋白FAM)通過(guò)脂質(zhì)

5、體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)入LoVo細(xì)胞，以未經(jīng)任何處理正常培養(yǎng)的LoVo細(xì)胞作為對(duì)照組，培養(yǎng)48h后消化收集細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，確定成功轉(zhuǎn)染后分別用免疫細(xì)胞化學(xué)S-P法和RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)β-catenin在蛋白和mRNA水平的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)該兩組細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)E-cadherin和MMP7的

6、表達(dá)水平、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD44v6的表達(dá)水平。最后通過(guò)細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及體外基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)研究轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力的變化情況。實(shí)驗(yàn)所得所有數(shù)據(jù)以(-x)±s(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05有顯著性差異。 結(jié)果；1.siRNA在LipofectaminTM2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率為72.36％，

7、(轉(zhuǎn)染條件：siRNA終濃度100nmol/L，體積比siRNA∶LipofectaminTM2000=10∶1)，表明已成功轉(zhuǎn)染； 2.轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組β-catenin在蛋白和mRNA水平的表達(dá)均明顯降低，其中在mRNA水平上的抑制率為76.2％； 3.免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞中E-cadherin、MMP-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組E-cadherin表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，而MMP7表達(dá)明顯下

8、降； 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞中CD44v6表達(dá)，結(jié)果顯示在對(duì)照組LoVo細(xì)胞中CD44v6表達(dá)的熒光強(qiáng)度為9.51±0.83，陽(yáng)性細(xì)胞率為13.29±4.04％；而在轉(zhuǎn)染組LoVo細(xì)胞中CD44v6表達(dá)的熒光強(qiáng)度為4.74±0.45，陽(yáng)性細(xì)胞率為7.73±3.08％，兩者相比無(wú)論熒光強(qiáng)度還是陽(yáng)性細(xì)胞率轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組均有明顯下降(P＜0.001)； 5.細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞與細(xì)胞間的同質(zhì)性黏

9、附明顯增強(qiáng)(t=-3.833，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組的黏附率分別為30.1±6.％和21.5±5.1％；而細(xì)胞與FN之間的異質(zhì)性黏附明顯減弱(t=11.539，P＜0.001)，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的黏附率分別為46.8±6.6％和65.6±6.5％； 6.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：劃痕法結(jié)果顯示24h后，對(duì)照組的無(wú)細(xì)胞條帶變窄程度較轉(zhuǎn)染組明顯，轉(zhuǎn)染組較24h前變化不明顯；48h后，轉(zhuǎn)染組無(wú)細(xì)胞條帶仍較明顯，而對(duì)照組無(wú)細(xì)胞條帶已基本被增殖

10、遷移的細(xì)胞填滿(mǎn)，提示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移能力明顯被抑制； 7.體外基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)為74.73±8.16/5個(gè)視野，對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)為111.69±8.79/5個(gè)視野，轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組顯著減少(t=6.955，P＜0.001)，提示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲遷移能力被有效抑制。 結(jié)論；β-catenin靶向siRNA可明顯降低LoVo細(xì)胞中β-catenin水平，進(jìn)一步上調(diào)E-cadherin、下調(diào)CD44v6和