口服凝集素化乙肝疫苗殼聚糖納米粒給藥系統(tǒng).pdf

1、注射乙型肝炎疫苗是目前普遍使用的病毒性肝炎預(yù)防手段,但作為肌內(nèi)注射制劑,存在制作費(fèi)用高、存儲(chǔ)及運(yùn)輸不便、患者不易耐受及需要專業(yè)技術(shù)人員給藥等問題。殼聚糖(chitosan,CS)納米粒載體是近年來用于包裹肽類、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和治療基因等生物大分子藥物的新一類給藥系統(tǒng),尤其適用于口服制劑,納米?？梢杂行Х乐沟鞍最愃幬镌谖改c道內(nèi)被酶降解,提高藥物的生物利用度。 本課題根據(jù)腸道粘膜及派伊爾集合淋巴結(jié)(peyer's patches,

2、PP)的免疫學(xué)特點(diǎn),將能同腸道微褶細(xì)胞上巖藻糖特異性結(jié)合的荊豆凝集素,對殼聚糖進(jìn)行修飾,作為載體材料,以乙肝表面抗原為模型藥物,依據(jù)“特洛伊木馬原則”(Trojanhorse's principle),構(gòu)建小腸黏膜中派伊爾集合淋巴結(jié)定位的乙肝疫苗納米?？诜o藥系統(tǒng),使疫苗穿過腸道黏膜和上皮細(xì)胞等形態(tài)學(xué)屏障,被微褶細(xì)胞攝取并定位于派伊爾集合淋巴結(jié)內(nèi)。 首先采用離子交聯(lián)-高壓勻化法,優(yōu)化處方工藝,制備了殼聚糖納米粒,考察殼聚糖的濃度

3、、殼聚糖與交聯(lián)劑三聚磷酸鈉(tripolyphosphate,TPP)質(zhì)量比及勻化過程對殼聚糖納米粒粒徑及多分散系數(shù)的影響,并考察了納米粒的得率。進(jìn)一步制備了包載乙肝疫苗的納米粒,測定其包封率和載藥量。建立凝膠排阻高效液相色譜法檢測乙肝疫苗,并進(jìn)行相應(yīng)方法學(xué)考察。采用戊二醛活化法制備凝集素化殼聚糖納米粒,并通過凝集素特異性結(jié)合底物牛頜下腺粘蛋白(BSM)與巖藻糖對凝集素的競爭性抑制結(jié)合試驗(yàn),驗(yàn)證凝集素在反應(yīng)前后活性的保持情況。以熒光素標(biāo)

4、記納米粒,考察凝集素修飾納米粒在小腸派伊爾淋巴結(jié)中的吸收和攝入情況。通過對體內(nèi)乙肝疫苗抗體滴度的測定,研究口服凝集素化乙肝疫苗納米粒在體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。 一、殼聚糖納米粒處方工藝及其藥劑學(xué)特性 1、以殼聚糖為材料,采用“離子交聯(lián)-高壓勻化法”制備殼聚糖納米粒,通過透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài)較規(guī)則。用激光散射粒度儀測定納米粒粒徑,平均粒徑在366.8nm,多分散系數(shù)為0.122,粒度分布較窄。 2、單因素考察發(fā)

5、現(xiàn)殼聚糖的濃度、殼聚糖與TPP質(zhì)量比對粒徑影響較大。 3、通過實(shí)驗(yàn)得到比較優(yōu)化制備工藝條件。最終采用制備條件為：殼聚糖濃度： 2mg/ml,(w/w),TPP:2mg/mL(w/w),交聯(lián)劑滴速為0.3mL/min。磁力攪拌速度為:600r/min。 4、通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)納米粒在放置6個(gè)月以后粒徑分布變寬,但是平均粒徑變化不大。 本部分確定的殼聚糖納米粒的制備方法,相關(guān)藥劑學(xué)參數(shù)的考察以及制備條件的優(yōu)化均為下

6、一部的研究積累了經(jīng)驗(yàn)。 二、乙肝疫苗檢測方法的確定及納米粒包封率測定 1、用凝膠排阻高效液相色譜法檢測乙肝疫苗的含量,乙肝疫苗保留時(shí)間在10.4min,并對其進(jìn)行方法學(xué)考察。 2、以低溫高速離心法測得乙肝疫苗納米粒平均包封率在90％以上,通過SDS-PAGE電泳表明,乙肝疫苗在反應(yīng)前后沒有發(fā)生分子量的變化。 本部分確立了用凝膠排阻高效液相色譜法檢測乙肝疫苗,簡便快捷。 三、荊豆凝集素修飾的殼聚糖納

7、米粒的制備和相關(guān)性質(zhì)考察 1、用凝膠排阻高效液相色譜法檢測荊豆凝集素和牛頜下腺粘蛋白(BSM)的濃度,線性良好。 2、用戊二醛活化法制備凝集素修飾的殼聚糖納米粒,結(jié)果表明:加入越多量的戊二醛,凝集素與納米粒結(jié)合率越大,最大結(jié)合率在85.3±3.2％,但是存在一定的飽和現(xiàn)象,即戊二醛的加入量增加到一定程度,結(jié)合率反而下降。 3、BSM與巖藻糖都是荊豆凝集素的特異性結(jié)合底物,所以巖藻糖的存在會(huì)讓BSM與凝集素化納米粒

8、的結(jié)合受到抑制。通過BSM與巖藻糖對凝集素的競爭性抑制實(shí)驗(yàn),說明凝集素在結(jié)合到納米粒表面后糖結(jié)合活性的保持。 本部分成功制備了凝集素化殼聚糖納米粒,為派伊爾集合淋巴結(jié)定向給藥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 四、凝集素化納米粒對小鼠派伊爾淋巴結(jié)的定位作用及體內(nèi)應(yīng)答反應(yīng) 1、制備熒光素化納米粒,灌胃給藥后,剖取出小腸中派伊爾淋巴結(jié),制成組織切片,用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)納米粒在淋巴結(jié)中有一定富集效果。 2、對BALB/c小鼠進(jìn)

9、行分組,分為市售制劑肌注組、口服凝集素化乙肝疫苗納米粒組、口服乙肝疫苗未凝集素化納米粒組、口服乙肝疫苗組、陰性對照組(生理鹽水),按一定時(shí)間間隔取血,分離血清,用乙肝表面抗體檢測試劑盒測定小鼠血清中抗體滴度。本部分進(jìn)行體外離體實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：凝集素化納米粒在小腸派伊爾淋巴結(jié)中是有富集的,并能在一定程度上引發(fā)免疫應(yīng)答。 目前國內(nèi)外多為凝集素對PLGA等材料進(jìn)行修飾后實(shí)現(xiàn)對蛋白或疫苗類藥物的口服給藥,凝集素對殼聚糖