凝集素修飾納米粒經(jīng)鼻入腦的遞藥特性研究.pdf

1、血腦屏障(BBB)是存在于血液和腦組織間的一層屏障系統(tǒng)，由極化的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通過復(fù)雜的細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成，它對于維系腦內(nèi)環(huán)境的相對恒定十分重要，同時(shí)也是藥物進(jìn)入腦組織發(fā)揮治療作用的主要屏障。隨著生物技術(shù)、神經(jīng)科學(xué)的迅速發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多具有中樞治療活性的多肽蛋白藥物，但由于BBB的存在，很大程度上限制了這些藥物的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和治療作用的發(fā)揮。因此，研究藥物，尤其是多肽蛋白類藥物的腦內(nèi)遞釋技術(shù)，具有很高的研究價(jià)值和臨床意義。 鼻

2、腦通路的存在為多肽蛋白藥物入腦提供了可能，但多肽蛋白藥物的透膜吸收能力差，給藥易受鼻腔中酶的降解和鼻纖毛的清除，因此經(jīng)鼻入腦的藥量仍然很低，無法達(dá)到有效的臨床治療效果。納米粒遞藥系統(tǒng)能夠有效減少多肽蛋白類藥物的降解，而且有望通過載體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加藥物的吸收。然而，普通納米粒鼻腔給藥仍存在三大問題：①納米粒的粒徑遠(yuǎn)大于細(xì)胞間隙，不易通過細(xì)胞間緊密連接被吸收，又無法有效誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞，因而透過鼻粘膜吸收的能力不很理想；②由于受到鼻纖毛的清除，

3、納米粒在鼻腔中通常僅能滯留15～20 min，因而往往尚未被完全攝取即被清除；③普通納米粒在鼻粘膜上的吸收缺乏部位選擇性：其可能通過呼吸部粘膜吸收增加藥物進(jìn)入血液循環(huán)，也可能通過嗅粘膜吸收增加藥物入腦，因而腦內(nèi)遞藥效率較差。 為了解決上述問題，本課題構(gòu)建了一種新型的經(jīng)鼻給藥腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)—凝集素修飾納米粒載藥系統(tǒng)。以納米粒作為多肽蛋白藥物的載體，可保護(hù)其體內(nèi)穩(wěn)定性；而納米粒表面修飾的麥胚凝集素(WGA)或荊豆凝集素(UEAI)可分

4、別與鼻腔嗅粘膜上選擇性高表達(dá)的糖基受體N-乙酰氨基葡萄糖或L-巖藻糖特異結(jié)合，延長載藥系統(tǒng)在鼻粘膜，尤其是嗅粘膜上的滯留時(shí)間，介導(dǎo)鼻粘膜特別是嗅粘膜對載藥系統(tǒng)的吸收，選擇性地遞送更多的藥物入腦，提高對中樞疾病的預(yù)防和治療效果，降低全身性的毒副作用。該遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建模式國內(nèi)外未見報(bào)道，具有較高的創(chuàng)新性。 本文第一部分為凝集素修飾納米粒的構(gòu)建和表征。將一定比例的甲氧基聚乙二醇—聚乳酸(MPEG-PLA)和馬來酰亞胺聚乙二醇—聚乳酸

5、(Maleimide-PEG-PLA)經(jīng)復(fù)乳/溶媒蒸發(fā)法制備得到納米粒(NP)，通過表面的馬來酰亞胺基與巰基化凝集素共價(jià)連接得到凝集素修飾納米粒。所得納米粒平均粒徑100nm以下，Zeta電位-20 mV。免疫電鏡觀察證實(shí)納米粒表面連接有凝集素；紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)證實(shí)連接于納米粒表面的凝集素仍具特異性糖基結(jié)合活性；以納米粒的粒徑、表面凝集素密度和蛋白連接效率為指標(biāo)，篩選優(yōu)化制備條件：MPEG-PLA∶Maleimide-PEG-PLA 質(zhì)量

6、比為9∶1；巰基化試劑2-IT∶蛋白摩爾比為60∶1；Maleimide-PEG-PLA∶蛋白摩爾比為3∶1；反應(yīng)時(shí)間為8-10 h。 為了評價(jià)凝集素修飾納米粒經(jīng)鼻給藥后的腦內(nèi)遞藥特性，第二部分采用香豆素-6 為熒光探針，觀察并測定載香豆素-6 的凝集素修飾納米粒經(jīng)鼻給藥后腦組織中的熒光探針強(qiáng)度，并對WGA 和 UEAI修飾納米粒鼻腔給藥后的腦內(nèi)靶向遞送效果進(jìn)行評價(jià)。 首先制備載香豆素-6 的凝集素修飾納米粒，通過體外泄

7、露實(shí)驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)證實(shí)香豆素-6 是一種較理想的熒光探針，可用于示蹤納米粒在大鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。定性觀察發(fā)現(xiàn)，鼻腔給予 NP 和 WGA 修飾納米粒(WGA-NP) 15 min 即可在嗅球、大腦組織切片中觀察到納米粒綠色熒光，說明納米粒鼻腔給藥后可迅速轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，納米粒經(jīng) WGA 修飾，其入腦量有所提高。定量測定結(jié)果顯示，WGA 和 UEAI 修飾顯著增加包載于納米粒中的香豆素-6 經(jīng)鼻給藥后的入腦量：WGA-NP和UEAI修飾納米

8、粒(UEA-NP)組腦組織中香豆素-6平均峰濃度分別為NP組的2.26(P<0.05)和1.33倍，藥時(shí)曲線下面積分別為NP組的1.97(P<0.05)和1.70倍(P<0.05)。3種納米粒的腦靶向效率依次為：UEA-NP>WGA-NP>NP。 第三部分將腦內(nèi)遞藥能力較強(qiáng)的WGA-NP用于包載多肽藥物—血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)，研究其用于多肽蛋白藥物腦內(nèi)遞送的可行性。采

9、用復(fù)乳/溶媒蒸發(fā)法制備載VIP的PEG-PLA納米粒(VIP-NP)，該納米粒與巰基化WGA共價(jià)連接制得WGA修飾納米粒(WGA-VIP-NP)，粒徑100nm左右，Zeta電位-20 mV。VIP-NP的包封率70％以上，載藥量可達(dá)1.4％。在血漿中12 h累積釋放約35％，在鼻洗液中8 h釋放17％，突釋效應(yīng)不大，顯示一定的緩釋特性。VIP-NP在血漿、鼻洗液中的穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于游離VIP溶液，為其體內(nèi)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。采用<'125>

10、I標(biāo)記VIP，HPLC偶聯(lián)γ計(jì)數(shù)器檢測腦組織中的完整<'125>I-VIP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIP溶液劑鼻腔給藥、皮下注射后15 min可在腦中檢測到完整VIP，隨著時(shí)間的延長，完整VIP所占比例減小，鼻腔給藥后1 h，皮下注射后 2 h，即在腦組織檢測不到完整 VIP。而鼻腔給予 <'125>I-VIP-NP 和WGA-<'125>I-VIP-NP，直到給藥后12 h，仍可在腦中檢測到完整VIP，說明采用納米粒包封 VIP，提高其穩(wěn)定性，大大

11、延長其體內(nèi)作用時(shí)間。VIP-NP 鼻腔給藥后腦內(nèi)完整VIP的AUC為VIP溶液鼻腔給藥的3.5-4.7倍(P<0.05)；VIP-NP 經(jīng)WGA修飾后鼻腔給藥，入腦量顯著提高，腦內(nèi)完整VIP的AUC為VIP溶液鼻腔給藥的5.6-7.7倍(P<0.05)。藥效學(xué)研究采用AF64A側(cè)腦室注射構(gòu)建大鼠中樞膽堿能神經(jīng)元損毀Alzheimer癥動(dòng)物模型，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)VIP制劑對大鼠空間記憶障礙的改善作用，測定大鼠海馬乙酰膽堿酯酶

12、活力評價(jià)VIP制劑對中樞膽堿能神經(jīng)元損毀的保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIP-NP鼻腔給藥后，能夠改善AF64A側(cè)腦室注射所致大鼠空間記憶障礙，提高大鼠海馬乙酰膽堿酯酶含量，對中樞膽堿能系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用。VIP-NP經(jīng)WGA修飾后，在劑量減半的情況下仍可產(chǎn)生明顯的記憶改善作用，顯著提高模型大鼠海馬乙酰膽堿酯酶含量，說明WGA-NP是更有效的遞藥系統(tǒng)，為具有腦內(nèi)治療活性藥物，特別是穩(wěn)定性差、難以通過血腦屏障的多肽蛋白藥物腦內(nèi)遞送提供了有效的載

13、體，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。第四部分對凝集素修飾納米粒經(jīng)鼻入腦轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理進(jìn)行研究。首先，以香豆素-6 為熒光探針，探討凝集素修飾納米粒經(jīng)鼻入腦轉(zhuǎn)運(yùn)通路。通過比較WGA-NP和NP不同時(shí)間在鼻粘膜不同部位分布情況發(fā)現(xiàn)：WGA-NP較NP具有更強(qiáng)的透粘膜吸收能力；在靠近嗅球的篩板處觀察到WGA-NP的分布量高于NP，說明WGA-NP 更易被攝取進(jìn)入嗅球。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合免疫熒光標(biāo)記區(qū)分嗅粘膜和呼吸部粘膜發(fā)現(xiàn)，相對于NP，WGA-NP 和 UEA-N

14、P 均呈現(xiàn)出在嗅粘膜上選擇性分布的特點(diǎn)。NP、WGA-NP 和 UEA-NP主要通過細(xì)胞內(nèi)途徑吸收。免疫熒光標(biāo)記嗅粘膜及粘膜下神經(jīng)束，初步確定WGA-NP經(jīng)嗅粘膜上皮細(xì)胞或腺體吸收進(jìn)入粘膜下層，經(jīng)神經(jīng)束或神經(jīng)束周圍結(jié)締組織轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。其次，以光穩(wěn)定性好的CdSe 量子點(diǎn)(QDs)作為熒光探針，采用大鼠在體鼻腔灌流技術(shù)對WGA-NP鼻粘膜吸收機(jī)理進(jìn)行探討。結(jié)果顯示，WGA的特異糖基N-乙酰氨基葡萄糖可顯著抑制鼻腔對WGA-QDs-NP的攝取

15、，說明WGA通過與鼻粘膜上的特異糖基結(jié)合，增加遞藥系統(tǒng)在鼻腔的滯留進(jìn)而介導(dǎo)其吸收。能量代謝抑制劑疊氮鈉顯著抑制鼻粘膜對WGA-QDs-NP的攝取，提示W(wǎng)GA-QDs-NP 以能量依賴方式吸收。包被凹陷內(nèi)吞抑制劑PhAsO和chlorpromazine顯著抑制鼻腔對WGA-QDs-NP的攝取，表明WGA-QDs-NP內(nèi)吞主要通過細(xì)胞膜上的clathrin蛋白構(gòu)成的包被凹陷介導(dǎo)；而細(xì)胞膜穴樣內(nèi)餡caveolae的內(nèi)吞抑制劑filipin對攝

16、取無顯著影響，說明caveolae途徑可能并非主要的內(nèi)吞途徑。高爾基體破壞劑BFA抑制鼻腔對WGA-QDs-NP的攝取，說明高爾基體參與WGA-QDs-NP在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)；溶酶體抑制劑Monensin抑制鼻腔對WGA-QDs-NP的攝取，提示至少部分WGA-QDs-NP在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中經(jīng)過溶酶體。該機(jī)理研究有助于闡明凝集素修飾納米粒的細(xì)胞吸收途徑，為后續(xù)的遞藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)提供思路。 為了評價(jià)WGA-NP鼻腔應(yīng)用的生理適應(yīng)性，第五部分考

17、察了該遞藥系統(tǒng)對鼻纖毛和鼻粘膜形態(tài)及細(xì)胞分化情況的影響。采用兩種模型評價(jià)WGA-NP對鼻粘膜纖毛的影響情況，結(jié)果顯示：WGA-NP對蟾蜍上顎粘膜纖毛運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間影響較小，與生理鹽水組對照，纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分率達(dá)90％以上；對大鼠鼻粘膜纖毛形態(tài)影響小，持續(xù)給藥6天后，大鼠鼻粘膜纖毛形態(tài)與生理鹽水陰性對照組相似，纖毛濃密，未出現(xiàn)明顯脫落，說明WGA-NP對鼻纖毛毒性小。鼻粘膜細(xì)胞形態(tài)觀察、嗅粘膜厚度測量和神經(jīng)特異性烯醇化酶免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)