馬鈴薯凝集素修飾聚乙二醇-聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物納米粒經(jīng)鼻入腦的遞藥特性研究.pdf

1、血腦屏障的存在限制了大多數(shù)具有治療活性的藥物（尤其是多肽蛋白類藥物）進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮療效。鼻腦通路的存在為多肽蛋白類藥物避開血腦屏障、直接轉(zhuǎn)運入腦提供了可能。但多肽蛋白藥物的透黏膜吸收能力差，易被鼻腔中的酶降解，加上鼻纖毛的清除作用，使得經(jīng)鼻轉(zhuǎn)運入腦的藥量仍然很低，無法達到滿意的治療效果。納米遞藥系統(tǒng)能夠有效減少多肽蛋白藥物的降解，而且有望通過載體的跨膜轉(zhuǎn)運增加藥物的吸收。但普通納米粒仍然存在透鼻黏膜吸收能力有限、鼻腔滯留時間短等局

2、限。
　　凝集素是一類具有高度特異性糖基結(jié)合活性的蛋白質(zhì)或糖蛋白，含有一個或多個可與單糖或寡糖特異且可逆結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域，利用其生物粘附特性可促進黏膜對藥物的吸收。本課題選擇馬鈴薯凝集素(Solanumtuberosumlectin,STL)作為靶向功能分子，將其修飾到聚乙二醇-聚（乳酸-羥基乙酸）共聚物(PEG-PLGA)納米粒的表面，構(gòu)建一種新型的遞藥系統(tǒng)(STL-NP)。STL能與鼻腔嗅黏膜上選擇性高表達的糖基受體（N-乙

3、酰氨基葡萄糖）特異結(jié)合，延長遞藥系統(tǒng)在鼻黏膜，尤其是嗅黏膜上的滯留時間，誘導黏膜的胞吞轉(zhuǎn)運，增加包載藥物經(jīng)鼻入腦的轉(zhuǎn)運量，以期提高對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療效果，并降低潛在的外周副作用。
　　本課題研究分為兩個部分。第一部分首先構(gòu)建了STL修飾的PEG-PLGA納米粒(STL-NP)，并對該納米遞藥系統(tǒng)進行表征。采用Calu-3細胞模型對其體外細胞攝取以及細胞毒性進行評價。通過測定載香豆素-6的NP和STL-NP鼻腔給藥后在血和腦組

4、織中的濃度，結(jié)合離體成像觀察納米粒鼻腔給藥后的腦分布情況，評價該遞藥系統(tǒng)的腦靶向性，并探索其經(jīng)鼻入腦的轉(zhuǎn)運通路。
　　第一部分：
　　第一章，采用復乳/溶媒蒸發(fā)法制備了PEG-PLGA納米粒，利用納米粒表面的馬來酰亞胺基團與巰基化凝集素共價連接，得到馬鈴薯凝集素修飾的PLGA納米粒(STL-NP)。該納米粒粒徑約110nm，Zeta電位約-30mV。X-射線光電子能譜(XPS)分析結(jié)果顯示，STL-NP納米粒表面的主要元素含

5、量發(fā)生變化，表明STL連接至納米粒的表面。紅細胞凝集實驗證實納米粒表面連接的凝集素仍保持其凝集紅細胞的生物活性，并且該凝集作用可被STL特異性糖基（N-乙酰氨基葡萄糖）抑制。
　　第二章，采用Calu-3細胞模型考察NP和STL-NP的細胞攝取及細胞毒性。結(jié)果顯示，Caiu-3細胞對STL-NP和NP的攝取均呈時間、濃度、溫度依賴性。Calu-3細胞對STL-NP有更快的胞吞速度和更強的胞吞能力。特異糖基抑制試驗結(jié)果顯示，STL介

6、導納米粒與細胞表面糖蛋白的特異性結(jié)合是促進細胞攝取的重要條件。胞吞抑制劑的攝取抑制試驗結(jié)果顯示:STL-NP首先通過STL與細胞表面的N-乙酰氨基葡萄糖殘基結(jié)合促使其吸附在細胞表面;隨即細胞通過包被凹陷、穴樣凹陷以及巨胞飲途徑將納米粒內(nèi)吞;入胞后，通過各期內(nèi)體，部分納米粒進入溶酶體逐漸降解，而部分納米粒逃脫溶酶體繼續(xù)轉(zhuǎn)運或在高爾基體的參與下被胞吐排出細胞;內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運過程是能量消耗的過程。MTT實驗結(jié)果顯示，STL-NP在濃度小于25mg

7、/mL時無細胞毒性，僅在濃度達50mg/mL時顯示輕微細胞毒性。蟾蜍上腭離體模型的結(jié)果顯示，NP和STL-NP對蟾蜍上腭黏膜纖毛無明顯毒性。以上結(jié)果說明，STL-NP是一種有效且安全的鼻用遞藥系統(tǒng)。
　　第三章，以香豆素-6為熒光探針定量測定NP和STL-NP鼻腔給藥后在血和腦組織中的濃度，結(jié)果顯示STL修飾后納米粒的鼻腔吸收和腦轉(zhuǎn)運速度增快，入腦量提高(p＜0.01)，而吸收入血量降低(p＜0.05)，對嗅球、大腦和小腦的腦靶向

8、效率分別為NP的1.92、2.45和1.89倍(p＜0.01)。以近紅外染料DiR為熒光探針進行離體組織臟器的成像觀察。結(jié)果顯示，STL-NP組在0.25～8h時間范圍內(nèi)腦部探針信號均強于NP。STL-NP和NP鼻腔給藥后主要分布于腎、肝、脾、肺等臟器。STL-NP鼻腔給藥后15min，探針信號即在嗅腦、大腦、腦干等部位廣泛分布。嗅球、前嗅核部位的探針信號在2h后逐漸減弱，而腦干、大腦、小腦部位的信號可持續(xù)8h以上。提示STL的修飾促進

9、了鼻黏膜對納米粒的吸收，STL-NP主要沿嗅通路和三叉神經(jīng)通路轉(zhuǎn)運入腦，其中三叉神經(jīng)通路的轉(zhuǎn)運更為持久。
　　本課題第二部分以堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)為模型藥物，制備了載bFGF的STL修飾PLGA納米粒（STL-bFGF-NP）并進行表征，采用同位素標記法對納米粒鼻腔給藥后腦內(nèi)遞藥特性進行考察。采用Aβ25-35和IBO海馬區(qū)共同注射建立AD大鼠模型，通過Morr

10、is水迷宮實驗評價bFGF各制劑組對AD模型大鼠空間學習記憶障礙的改善作用，結(jié)合生化指標測定和免疫組化研究觀察海馬區(qū)的病理變化。然后對STL-bFGF-NP鼻腔連續(xù)給藥3周后的短期毒性進行考察，觀察鼻黏膜的細胞分化和形態(tài)的變化情況，以及對主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）的毒性情況。
　　第二部分：
　　第一章，采用復乳/溶媒蒸發(fā)法制備包載bFGF的PLGA納米粒(bFGF-NP)，該納米粒與巰基化STL共價連接制得STL-bF

11、GF-NP。bFGF-NP和STL-bFGF-NP粒徑均為110nm左右，Zeta電位為-30mV左右。STL-bFGF-NP的包封率和載藥量較bFGF-NP會有所降低。bFGF-NP在血漿和鼻黏膜勻漿液中的穩(wěn)定性較bFGF明顯提高。bFGF-NP在血漿和鼻洗液中雖有一定的突釋(0.5h的釋放量分別為11.40％和6.32％)，但24h累積釋放量分別為73.09％和41.91％，顯示出一定的緩釋作用。
　　第二章，采用碘標記法對S

12、TL-bFGF-NP鼻腔給藥后的腦內(nèi)遞藥特性及體內(nèi)分布進行考察。結(jié)果顯示，bFGF溶液、bFGF-NP和STL-bFGF-NP鼻腔給藥后入腦量均較bFGF溶液靜脈給藥提高，其中STL-bFGF-NP在嗅球、大腦、小腦中的AUC0-24h分別為bFGF溶液靜脈給藥組、bFGF溶液鼻腔給藥組、bFGF-NP組的1.79～5.17倍(p＜0.05)、1.61～3.21倍(p＜0.05)和1.19～2.06倍(p＜0.05)，腦靶向效率也分別提

13、高3.61～10.5倍(p＜0.01)、1.33～2.69倍(p＜0.05)和1.18～2.06倍(p＜0.01)。STL-bFGF-NP鼻腔給藥后轉(zhuǎn)運到三個腦組織的直接轉(zhuǎn)運百分率均大于70％，尤其對嗅球的直接轉(zhuǎn)運百分率高達90％，說明STL修飾后促進了藥物經(jīng)嗅通路轉(zhuǎn)運入腦。體內(nèi)分布結(jié)果顯示，bFGF各制劑組鼻腔給藥后在各臟器的分布均顯著低于靜脈給藥組，尤其在腎、肝、脾中分布的減少有利于降低bFGF的外周副作用，提高其臨床應用性。bFG

14、F-NP和STL-bFGF-NP組在各臟器中的分布較bFGF溶液鼻腔給藥組無顯著性差異。
　　第三章，藥效學研究結(jié)果顯示，bFGF各制劑組對AD模型大鼠的空間記憶障礙有不同程度的改善作用，其中STL-bFGF-NP組(20μg/kg/d)顯示出更快的學習速度。bFGF-NP高劑量組(40μg/kg/d)和STL-bFGF-NP組在長期和短期記憶考察中均顯示出更好的記憶效果。STL-bFGF-NP治療可降低AD大鼠海馬AChE活性，

15、提高ChAT水平至AD模型組的2.04倍，對膽堿能神經(jīng)纖維具有維持存活和營養(yǎng)保護的作用;且能夠減輕Aβ斑塊在海馬區(qū)的沉積，減少海馬區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡，從而對AD模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用。
　　第四章，對STL-bFGF-PLGA納米粒進行了為期3周的短期毒性考察，結(jié)果顯示鼻黏膜及心、肝、脾、肺等臟器均未發(fā)生明顯的組織病理學改變。由于腎臟是bFGF的主要毒性靶器官，鼻腔給藥組的變性程度較靜脈給藥組明顯減輕，提示鼻腔給藥可減輕