β-聚蘋果酸—聚乙二醇—葉酸納米共聚物的合成及其性質(zhì)研究.pdf

1、大部分抗腫瘤藥物沒有特異毒性，缺乏腫瘤選擇性，并且部分腫瘤具有多藥耐藥性，這些因素導(dǎo)致了療效的降低。為了使抗腫瘤藥物最大程度地發(fā)揮療效，抗腫瘤藥物運(yùn)載系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，在腫瘤靶向治療方面占有重要地位并具有很好的應(yīng)用前景。近幾十年來(lái)，科研工作者們?cè)诰酆衔锼幬镞\(yùn)載系統(tǒng)的領(lǐng)域取得了很多成果，比如將脂質(zhì)體，微球，納米粒，膠束等運(yùn)用于藥物運(yùn)載。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可通過化學(xué)鍵合藥物或者物理包封藥物，提高了抗腫瘤藥物的利用率，使其水溶性得到很大改善，體內(nèi)半衰期

2、延長(zhǎng)。同時(shí)，可以在載體的表面修飾抗體或者配體達(dá)到主動(dòng)靶向的效果。
　　盡管很多藥物運(yùn)載系統(tǒng)表現(xiàn)出了相當(dāng)好的腫瘤靶向性，通過抗原-抗體、受體-配體之間特異性結(jié)合將藥物主動(dòng)靶向至腫瘤細(xì)胞表面，但由于載體與靶細(xì)胞結(jié)合后入胞能力較弱，并不能提供足夠高的胞內(nèi)藥物濃度，而細(xì)胞毒性藥物必須進(jìn)入細(xì)胞才能發(fā)揮作用，因而無(wú)法有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，特別是具有多藥耐藥性的腫瘤細(xì)胞；且載體在胞外釋放的藥物經(jīng)過擴(kuò)散后有可能重新分布到正常組織中，降低靶向藥物

3、的特異性。因此，生物活性分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)仍是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的一個(gè)關(guān)鍵問題。因此，除了構(gòu)建主動(dòng)靶向藥物運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)外，必須尋找一種能將藥物高效介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞的方法，使更多的藥物到達(dá)腫瘤部位后進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，提高藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率，真正達(dá)到腫瘤靶向給藥的目的。
　　細(xì)胞穿膜肽（cell-penetratingpeptides，CPP），作為一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的短肽，其穿膜作用不依賴經(jīng)典的胞吞作用，具有細(xì)胞親和性高、穿膜速度快、可迅速被降

4、解的特點(diǎn)。其中，尤以轉(zhuǎn)錄激活蛋白（transcriptionalactivatorprotein，TAT）研究最為成熟。TAT是源自人免疫缺陷病毒Tat蛋白的一段堿性氨基酸多肽，能直接穿過細(xì)胞膜，迅速將與之連接的大分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部。但是，TAT缺乏靶向特異性，對(duì)任何細(xì)胞具有相同的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，甚至包括具有多藥耐藥性的腫瘤細(xì)胞。
　　因此我們構(gòu)想一種屏蔽/去屏蔽的方法來(lái)解決TAT缺乏特異性的問題，即TAT在到達(dá)靶向區(qū)域前被隱藏，避免T

5、AT介導(dǎo)的非特異性穿膜；在到達(dá)靶向區(qū)域后，TAT完全暴露促進(jìn)有效的細(xì)胞內(nèi)化。在這一構(gòu)想中，選用β-聚蘋果酸為基材，在其主鏈上分別鍵合不同長(zhǎng)度的PEG鏈和抗腫瘤藥物。利用不同長(zhǎng)度的PEG鏈同時(shí)運(yùn)載配體、穿膜肽、生物素、單克隆抗體或靶向分子，使它們互不干擾。在腫瘤部位酸性環(huán)境下，依次發(fā)揮靶向累積及內(nèi)化入胞作用。在正常體循環(huán)中（pH>7.2），短鏈PEG上的TAT隱蔽在長(zhǎng)鏈PEG的保護(hù)層中；在腫瘤部位酸性環(huán)境中，靶向分子介導(dǎo)藥物載體大量聚集于

6、腫瘤細(xì)胞表面，連接長(zhǎng)鏈PEG的酸敏部位迅速解離，穿膜肽暴露于載體表面，實(shí)現(xiàn)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效內(nèi)化。
　　大量文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)靶向分子通過酰胺鍵或者酯鍵與藥物載體鍵合,其在生理pH和腫瘤細(xì)胞外弱酸環(huán)境中的穩(wěn)定性較好。為了實(shí)現(xiàn)這一構(gòu)想，我們選用在弱酸環(huán)境中更易斷裂的腙鍵作為酸敏部位，將β-聚蘋果酸通過酸性敏感基團(tuán)腙鍵鍵合帶有靶向分子的α-羥基-ω-醛基聚乙二醇（長(zhǎng)鏈PEG），以達(dá)到在腫瘤部位酸性環(huán)境長(zhǎng)鏈PEG解離的效果。
　　本研究中

7、，采用經(jīng)過水合肼修飾后帶有酰肼鍵的β-聚蘋果酸為納米共聚物的主鏈，通過腙鍵鍵合醛基-聚乙二醇-葉酸（CHO-PEG-FA），制得β-聚蘋果酸-聚乙二醇-葉酸（β-PMLA-PEG-FA）納米共聚物，探討該納米共聚物中腙鍵在弱酸性環(huán)境中斷鍵的特性。本研究為制備多功能β-聚蘋果酸藥物載體提供了重要的前期工作基礎(chǔ)。
　　1β-聚蘋果酸的合成
　　以L-天冬氨酸為原料合成β-烷氧羰基β-丙內(nèi)酯，以其為單體，在引發(fā)劑的作用下進(jìn)行開環(huán)聚

8、合形成鏈狀物，氫解去除芐基后得到β-PMLA。紅外光譜和核磁共振圖譜表征產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
　　2醛基-聚乙二醇-葉酸的制備
　　定量稱取葉酸和α-羥基-ω-醛基聚乙二醇溶于無(wú)水DMSO中，在EDC·HCl和DMAP的催化下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后透析除去未反應(yīng)的小分子，冷凍干燥得到醛基聚乙二醇-葉酸。
　　3帶有酰肼鍵的β-聚蘋果酸的制備
　　定量稱取PMLA和NHS溶于DMF中，室溫下反應(yīng)片刻。加入EDC·HCl，在其催化作

9、用下冰浴反應(yīng)。加入5％水合肼溶液，室溫下反應(yīng)。反應(yīng)液用蒸餾水透析兩天，冷凍干燥后得到帶有酰肼鍵的β-聚蘋果酸。
　　4β-聚蘋果酸-聚乙二醇-葉酸納米共聚物的制備和表征
　　定量稱取醛基聚乙二醇-葉酸和帶有酰肼鍵的β-聚蘋果酸溶于DMF中，在EDC·HCl的催化下反應(yīng)。反應(yīng)液用蒸餾水透析兩天，透析后的溶液冷凍干燥，得到β-聚蘋果酸-聚乙二醇-葉酸。采用核磁共振表征該共聚物的結(jié)構(gòu)。紫外分光光度法測(cè)定葉酸的含量為4.5wt％。<

10、br>　　5β-聚蘋果酸-聚乙二醇-葉酸的體外腙鍵斷裂研究
　　動(dòng)態(tài)透析法研究不同pH值葉酸的解離情況，即葉酸在不同pH緩沖液中的穩(wěn)定性。釋放出的葉酸濃度使用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定。隨著pH值的減小，葉酸的解離速度加快。在pH5.5、pH6.5及pH7.4的PBS緩沖體系中，6h后配體葉酸累積解離率分別為88.1％，85.3％和41.6％。
　　6β-聚蘋果酸-聚乙二醇-葉酸的細(xì)胞毒性研究
　　以人肝癌S