紫杉醇-葉酸-聚乙二醇-聚谷氨酸芐酯共聚物膠束的自組裝及藥學(xué)研究.pdf

1、紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)，是從紅豆杉屬植物中提取出來的一種具有高效抗腫瘤活性的天然物質(zhì)。它是一種新型的微管穩(wěn)定劑，具有獨特抗癌活性。自1992年12月美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)紫杉醇用于治療晚期卵巢癌以來，其在臨床上的應(yīng)用范圍逐漸擴展，并從二線藥物變成一線用藥，可以說是目前最好的抗癌藥物之一。
　　 紫杉醇是一種天然的三環(huán)二萜物質(zhì)，有一個龐大繁雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及眾多的疏水性取代基，因而在水中的溶解性很差

2、。臨床應(yīng)用的主要是紫杉醇注射液，即由乳浮EL(Cremophor EL，含聚氧乙烯蓖麻油)/無水乙醇(50：50)制成的無色黏稠狀濃溶液。這種傳統(tǒng)劑型設(shè)計的目的是為了改善紫杉醇的水溶性。但大量研究顯示聚氧乙烯蓖麻油在體內(nèi)可促使大量組織胺釋放，產(chǎn)生過敏反應(yīng)，而且還可溶解聚氯乙烯(PVC)輸液器中的二乙烯己基鄰苯二甲酸鹽，帶來嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，大大影響紫杉醇的臨床安全應(yīng)用。
　　 基于上述原因，國內(nèi)外眾多科學(xué)家對紫杉醇的劑型改造進(jìn)行了

3、大量研究。本研究設(shè)計了一種兩親型嵌段共聚物，其親水段為葉酸-聚乙二醇(Folate-PEG)，在人體內(nèi)不會產(chǎn)生毒、副作用，無免疫源性，而疏水段為可生物降解的聚L-谷氨酸γ-芐酯(PBLG)，其降解產(chǎn)物為內(nèi)源性物質(zhì)谷氨酸，在體內(nèi)不易產(chǎn)生蓄積和毒副作用，因此利用兩組分形成的嵌段共聚物(Folate-PEG-PBLG)具親水和疏水性為一體，在水溶液中可自組裝形成球形核-殼結(jié)構(gòu)的納米膠束系統(tǒng)，其中疏水嵌段構(gòu)成內(nèi)核并作為微藥庫通過化學(xué)鍵合或物理包

4、埋的方式結(jié)合紫杉醇，極大地增加紫杉醇的水溶性，釋藥具有突釋階段和緩釋作用。同時親水嵌段Folate-PEG作為膠束的外核，使納米膠束躲避體內(nèi)免疫系統(tǒng)的層層監(jiān)視，降低被肝脾肺中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝取，延長膠束在血液中循環(huán)時間。接枝葉酸的膠束，對腫瘤細(xì)胞的葉酸受體具有親和力，提高腫瘤組織中藥物紫杉醇的含量。
　　 圍繞上述研究目的，本文主要探討了以下幾方面的內(nèi)容。
　　 (1)聚乙二醇一聚谷氨酸芐酯(PEG-PBLG)嵌

5、段共聚物的合成與表征
　　 以單甲氧端基聚乙二醇(MePEG)和L-谷氨酸為原料，合成了一系列組成的PEG-PBLG嵌段共聚物，利用IR、1H-NMR對聚合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，經(jīng)陰離子聚合可以生成PEG-PBLG嵌段共聚物，其中PBLG嵌段的優(yōu)勢構(gòu)象為α螺旋構(gòu)象。
　　 (2)葉酸-聚乙二醇一聚谷氨酸芐酯(Folate-PEG-PBLG)共聚物合成與表征
　　 雙端氨基的聚乙二醇(AT-PEG)在無水環(huán)

6、境下偶聯(lián)Folate，生成Folate-PEG-NH2,作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。通過引發(fā)劑Folate-PEG-NH2(I)引發(fā)活性單體BLG-NCA(A)的開環(huán)聚合，合成了一系列的Folate-PEG-PBLG嵌段共聚物，通過調(diào)節(jié)[A]/[I]的比例可控制聚合物的分子量。用IR、1H-NMR表征聚合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，F(xiàn)olate-PEG-NH2可引發(fā)高活性的BLG-NCA，經(jīng)陰離子聚合反應(yīng)生成Folate-PEG-PBLG共聚物，隨著

7、[A]/[I]的增加，共聚物分子量變大。
　　 (3)Folate-PEG-PBLG納米膠束的自組裝
　　 用膜透析法等不同方法制備Folate-PEG-PBLG兩親嵌段共聚物的納米膠束，考察其粒徑變化。用液相(HPLC)、紫外分光光度計(uv)驗證Folate-PEG-PBLG膠束對難溶性的不同藥物包埋，用HPLC、UV測定了膠束的載藥量和包封率。結(jié)果表明，F(xiàn)olate-PEG-PBLG膠束能包埋疏水性藥物，其載藥量與

8、載體的嵌段比有很大關(guān)系，疏水嵌段過大或過小都會引起膠束不穩(wěn)定，載藥量下降；載藥量隨投藥量的增加而增加，但超過膠束包埋能力后，其包封率很快降低。
　　 (4)Folate-PEG-PBLG納米膠束性質(zhì)的研究
　　 用膜微透析法制備了Folate-PEG-PBLG納米膠束，通過SEM觀察該膠束粒子外部形態(tài)，用芘熒光探針法測定了臨界膠束濃度(CMC)，通過動態(tài)光散射(DLS)測定了納米膠束的粒徑。結(jié)果表明，用膜微透析法制備納米

9、膠束呈球形或橢球形。Folate-PEG-PBLG膠束的粒徑與載體聚合物的疏水嵌段，溶劑組成及載體聚合物濃度有關(guān)。疏水嵌段比例愈高，膠束粒徑愈大；溶劑組成由純DMF所得的膠束粒徑最小且其載藥膠束穩(wěn)定；聚合物濃度愈大，透析所得膠束粒徑愈大；載藥膠束粒徑受投藥料比的影響不顯著。
　　 (5) Folate-PEG-PBLG膠束的體外釋放試驗
　　 采用UV和HPLC測定不同藥物的載藥膠束在釋藥介質(zhì)中藥物的含量，觀察Folat

10、e-PEG-PBLG載藥膠束的體外釋放特性，考察了釋藥介質(zhì)在Folate-PEG-PBLG載藥膠束中對釋藥的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)olate-PEG-PBLG膠束釋藥過程具有突釋階段和緩釋作用，釋藥介質(zhì)的pH與被包埋藥物的溶解性關(guān)系緊密，因而對其載藥膠束的釋藥有很大影響。
　　 (6)Taxol/Folate-PEG-PBLG凍干粉針劑的制備研究
　　 Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束采用凍干粉針劑，輔料甘露醇

11、的含量5％，其溶液的最低共溶點是-18℃。凍結(jié)分了三個階段，干燥分兩個階段，凍干后所得樣品與透析所得新鮮載藥膠束溶液的釋藥曲線基本相符。
　　 (7)Folate-PEG-PBLG聚合物的細(xì)胞毒性試驗
　　 采用MTT法比較，在不同濃度下Folate-PEG-PBLG聚合物與紫杉醇注射劑中增溶劑聚氧乙烯化蓖麻油的體外Hela細(xì)胞毒性。結(jié)果表明：Folate-PEG-PBLG聚合物對Hela細(xì)胞增殖抑制作用很低，接枝葉酸后

12、所得的Folate-PEG-PBLG沒有增加PEG-PBLG聚合物對Hela細(xì)胞的毒性。與臨床所用紫杉醇注射劑中增溶劑的細(xì)胞毒性相比，F(xiàn)olate-PEG-PBLG聚合物的細(xì)胞毒性降低。
　　 (8)Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束體外藥效試驗
　　 在不同Taxol藥物濃度下，采用MTT法比較了Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束與臨床使用的紫杉醇注射劑對癌細(xì)胞療效。結(jié)果表明，當(dāng)含紫杉醇濃度高于

13、20μg/ml時，因溶液為飽和紫杉醇濃度，對癌細(xì)胞的抑制殺滅效果是一樣的。各個實驗組細(xì)胞毒性評分均為4，表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性：低于20μg/ml，Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束包裹的藥物僅部分釋放，殺滅癌細(xì)胞療效要遠(yuǎn)低于具有增溶劑毒性的紫杉醇注射劑(P<0.01)。
　　 (9)Folate-PEG-PBLG膠束對葉酸受體選擇性研究
　　 在無葉酸培養(yǎng)基中，F(xiàn)olate-PEG-PBLG載藥膠束與無葉酸基團(tuán)

14、的PEG-PBLG載藥膠束相比，能顯著的降低對具有高水平葉酸受體表達(dá)的H0-8910、HepG-2的細(xì)胞相對增殖百分率(RGR)(P<0.01)；而對無高水甲葉酸受體表達(dá)A549的RGR，兩者沒有顯著性差異(P>0.05)。在利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀研究后表明：培養(yǎng)基中無游離葉酸，接枝葉酸的膠束，具有高水甲葉酸受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，這三者同時存在情況下，膠束才特異性表達(dá)與腫瘤細(xì)胞中葉酸受體的結(jié)合。以上說明：Folate-PEG-PBLG

15、膠束對具有高水平葉酸受體表達(dá)的HO-8910、HepG-2腫瘤細(xì)胞具有靶向性。
　　 (10)Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束的藥效學(xué)實驗
　　 采用腫瘤瘤塊皮下移植法建立了人肝癌HepG-2細(xì)胞裸鼠移植模型，對比觀察了Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束與紫杉醇注射劑對裸鼠肝癌模型的療效。結(jié)果表明，裸鼠皮下移植瘤塊可成功建立了人肝癌裸鼠移植模型。Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束對裸

16、鼠的腫瘤生長具有明顯抑制作用。Taxol/Folate-PEG-PBLG組治療腫瘤療效高于紫杉醇注射劑組(P<0.01)，而制劑毒性明顯低于紫杉醇注射劑組。
　　 (11)Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究
　　 Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束組的AUCo-t、MRT、CL等與紫杉醇注射劑對照組比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，載藥膠束組的半衰期t1/2可升高至2

17、.44倍，延長了載藥膠束微粒在體循環(huán)中時間。實驗表明紫杉醇載藥膠束該制劑提高了藥物生物利用度，提高了半衰期t1/2,相比臨床所用紫杉醇注射劑有一定進(jìn)步。
　　 (12)Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束在荷瘤裸鼠中的體內(nèi)分布
　　 Taxol/Folate-PEG-PBLG膠束改變了藥物紫杉醇的溶解性，進(jìn)而改變其在肺蓄積分布。載藥膠束表面親水性的PEG長鏈，可以躲避RES識別與攝取，延長膠束體循環(huán)時間，從而降

18、低了紫杉醇在肝臟等臟器的濃度。接枝葉酸的膠束能特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞中葉酸受體，提高藥物在腫瘤組織中濃度，表明接枝葉酸膠束具有腫瘤靶向性。
　　 綜上所述，以Folate-PEG-PBLG嵌段共聚物為載體，制備了紫杉醇自組裝核殼型納米膠束系統(tǒng)，該膠束系統(tǒng)具有良好的粒徑分布和緩釋作用，低材料毒性和在動物實驗中表現(xiàn)良好的抗腫瘤作用，降低了紫杉醇在肝臟等臟器的濃度，提高在腫瘤組織中濃度。使紫杉醇納米膠束劑型達(dá)到高效、低毒的目的，為紫杉醇的