去甲斑蝥素-聚乙二醇-聚已內(nèi)酯嵌段共聚物膠束的研制.pdf

1、背景:由親水端聚乙二醇(PEG)和疏水端聚己內(nèi)酯(PCL)組成的兩親性嵌段共聚物材料聚乙二醇-聚已內(nèi)酯(PEG-PCL)，由于具有生物相容性和可降解性的特點(diǎn)，備受人們的關(guān)注。在水中，PEG-PCL自組裝形成含有疏水內(nèi)核和親水外核的膠束結(jié)構(gòu)。聚合物膠束給藥系統(tǒng)是近年來研究十分活躍的抗腫瘤給藥系統(tǒng)。膠束既提供了一個(gè)疏水的內(nèi)核作為藥物儲(chǔ)庫(kù)，又提供了一個(gè)親水的外膜以維持在水性環(huán)境中的穩(wěn)定性。正是由于特殊的結(jié)構(gòu)，膠束可以增加藥物在體內(nèi)外的穩(wěn)定性，

2、增加疏水性藥物的溶解性，并改善藥物分子的傳遞性能。作為新型的藥物傳遞系統(tǒng)，聚合物膠束還具備有其他誘人的性質(zhì)，諸如具有良好的生物相容性，增加生物利用度等。由于膠束具有較小的粒徑，因此它很容易通過“滲透和保留”（ERP）效應(yīng)聚集在腫瘤組織，起到靶向作用，同時(shí)還能減輕對(duì)正常組織的毒副作用。
　　 本課題就是利用PEG-PCL兩嵌段共聚物包載抗腫瘤藥去甲斑蝥素(NCTD)。去甲斑蝥素是斑蝥素經(jīng)去甲基結(jié)構(gòu)改造而來的。斑蝥素是我國(guó)昆蟲大斑蝥

3、（mylabris）干燥蟲體的有效成分。研究表明，去甲斑蝥素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，且抑瘤譜廣，對(duì)原發(fā)性肝癌，結(jié)腸癌，口腔癌，肺癌，卵巢癌及乳腺癌等均有效。去甲斑蝥素的抗腫瘤機(jī)制主要是抑制腫瘤細(xì)胞的增值，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及阻止細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)。但是，由于去甲斑蝥素水溶性差及對(duì)泌尿系統(tǒng)的刺激作用強(qiáng)，因此它的臨床應(yīng)用受到很大的限制。
　　 藥物溶解度是影響藥物釋放和吸收的重要因素，然而去甲斑蝥素的溶解性并不讓人樂觀，在pH=6.0的水中溶解

4、度僅為2.5mg/mL，當(dāng)pH=9.5時(shí)，它的溶解度漲至9.5 mg/mL。臨床上，去甲斑蝥素通常以pH=9的鈉鹽注射于人體內(nèi)，高的pH值是去甲斑蝥素用于靜脈注射產(chǎn)生強(qiáng)刺激性的重要因素。經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后的去甲斑蝥素毒性雖然有所降低，但是對(duì)泌尿系統(tǒng)的刺激仍然存在，當(dāng)用藥劑量較大或長(zhǎng)期用藥后，由于藥物在各組織器官分布廣泛，對(duì)機(jī)體可產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，這是限制了其在臨床上應(yīng)用的又一原因。因此應(yīng)該把開發(fā)去甲斑蝥素的新劑型放在第一位，其目的在于改善藥

5、物的溶解性，降低毒性，增強(qiáng)療效。
　　 本課題的目的在于制備去甲斑蝥素-聚乙二醇-聚已內(nèi)酯的聚合物膠束并優(yōu)化其工藝。通過透射電鏡驗(yàn)證膠束結(jié)構(gòu)的形成，并通過紅外光譜驗(yàn)證藥物被包載在膠束里核。檢測(cè)聚合物的臨界膠束濃度在于說明膠束的耐稀釋性。比較凍干品與去甲斑蝥素的穩(wěn)定性。體外釋放性能，體外抗腫瘤活性及體內(nèi)抗腫瘤活性等研究是為了闡述載藥膠束潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 第一部分:去甲斑蝥素-聚乙二醇-聚已內(nèi)酯兩嵌段共聚物膠束的制

6、備及工藝優(yōu)化
　　 聚合物膠束的制備采用透析法和揮發(fā)透析法，用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定藥物濃度，析因設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝，以載藥量，包封率和粒徑的綜合值(OD)作為考察指標(biāo)。單因素考察結(jié)果表明制備方法，有機(jī)溶劑的種類以及藥物與聚合物的投料比影響OD值的大小，因此將這三因素作為考察因素。
　　 析因設(shè)計(jì)結(jié)果表明:當(dāng)制備方法為揮發(fā)透析法，溶劑為四氫呋喃，投料比為0.0625:1時(shí)制得的聚合物膠束粒徑為(95.6±10.1)n

7、m，載藥量為（6.0±0.3）％，包封率為（79.1±0.8）％，此時(shí)的OD值最大。
　　 第二部分:表征
　　 PEG-PCL聚合物臨界膠束濃度(CMC)的測(cè)定:采用熒光探針法測(cè)定PEG-PCL的CMC，制備一系列不同濃度的空白膠束溶液，分別加入相同量的芘，在發(fā)射波長(zhǎng)393nm處，測(cè)定各樣品在335nm和338nm處的激發(fā)光強(qiáng)度，以1gC為橫坐標(biāo)，I338/335為縱坐標(biāo)作圖，拐點(diǎn)處即為該聚合物的CMC，實(shí)驗(yàn)得PEG-

8、PCL的CMC為0.3×10-6mol·L-1。當(dāng)CMC達(dá)到10-6級(jí)，膠束能夠保持在體內(nèi)外的穩(wěn)定性，即使在體液的稀釋中也能保持完整的結(jié)構(gòu)。
　　 載藥膠束和空白膠束粒徑大小比較:用馬爾文粒徑測(cè)定儀測(cè)量在相同制備條件下制得的載藥膠束和空白膠束的粒徑大小。結(jié)果顯示:空白膠束的粒徑為(126.55±0.28)nm，載藥膠束的粒徑為(87.12±0.17)nm，顯然，載藥膠束的粒徑反而小于空白膠束。藥物進(jìn)人膠束內(nèi)核后與聚已內(nèi)酯發(fā)生了范

9、德華力，氫鍵等作用，空間被壓縮，因此粒徑小于空白膠束。
　　 膠束形態(tài)觀察:采用透射電鏡(TEM)觀察空白膠束和載藥膠束的形態(tài)和粒徑大小。首先進(jìn)行樣品的負(fù)染色，將樣品滴到碳膜銅網(wǎng)上，待干后用2％的磷鎢酸負(fù)染色，最后于透射電鏡下觀察。透射電鏡觀察到空白膠束和載藥膠束除了粒徑大小外，在形狀上沒有顯著性差別，均呈球形的核-殼結(jié)構(gòu)，膠束的親水段因吸收了磷鎢酸所以顯深黑色，里核的疏水部分未吸收磷鎢酸所以呈淺色。透射電鏡結(jié)果表明在膠束構(gòu)建過

10、程中，核-殼結(jié)構(gòu)己完全形成。
　　 紅外(IR)表征:將空白膠束，載藥膠束，聚合物和去甲斑蝥素的物理混合物三者完全干燥后加適量KBr壓片，用傅里葉紅外光譜觀察三者的紅外吸收。結(jié)果顯示載藥膠束和空白膠束具有相同的紅外吸收峰，而這些吸收均為PEG-PCL的特征吸收峰。藥物和聚合物的物理混合物既顯現(xiàn)了聚合物的特征吸收，還顯現(xiàn)了去甲斑蝥素的特征吸收峰。紅外光譜結(jié)果表明:未被包載的游離藥物已被除盡，IR是控制聚合物膠束純度的好方法。

11、>　　 第三部分:穩(wěn)定性研究
　　 凍干保護(hù)劑的選擇:采用半乳糖，甘露醇，海藻糖作為凍干保護(hù)劑，考察不同凍干保護(hù)劑對(duì)載藥膠束的外觀形態(tài)、粒徑及分布的影響。結(jié)果顯示:用海藻糖作為凍干保護(hù)劑制得的凍干品外觀形態(tài)良好且具有最小的粒徑。
　　 穩(wěn)定性:將膠束凍干粉和去甲斑蝥素分別都置于40℃，60℃，強(qiáng)光下，1、3、5、10d后采樣，考察不同條件下膠束和去甲斑蝥素的保存率。把凍干制劑和去甲斑蝥素放在75％和92.5％濕度條件下

12、，1、3、5、10d后采樣后，檢查重量變化率。結(jié)論:1.40℃下，膠束10d后的保存率顯著高于去甲斑蝥素。2.膠束凍干品不耐60℃的高溫，在60℃下，凍干品開始融化。因此凍干品在保存過程中要避免高溫的破壞。3.強(qiáng)光下，膠束和去甲斑蝥素10d后的保存率沒有顯著性差異。4.去甲斑蝥素易吸潮，制成膠束凍干粉后可以改善藥物的濕穩(wěn)定性。
　　 室溫留樣考察膠束凍干樣品的穩(wěn)定性:將膠束凍干品于室溫下密封放置，于第0，1,2，3個(gè)月取樣，檢測(cè)

13、粒徑和包封率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明凍干樣品在常溫下密封放置三個(gè)月后膠束的粒徑和包封率沒有顯著變化。
　　 第四部分:體外釋放性能與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　 體外釋放研究:精密量取相同體積的膠束溶液于透析袋中，置于含一定量的釋放介質(zhì)（磷酸鹽緩沖液含1％SDS，pH分別為6.5，7.0，7.4）的EP管中，37℃恒溫振蕩(100r·min-1)，分別于不同的時(shí)間點(diǎn)下將釋放液全部取出，同時(shí)注入相同量的新鮮釋放介質(zhì)。高效液相測(cè)定藥物濃度，并作

14、累積釋放曲線。結(jié)果顯示:72h后，藥物從膠束中釋放到pH為6.5，7.0，7.4的釋放液的量分別為（83.4±2.5）％，(80.0±1.6)％和（72.0±1.5）％。結(jié)論:載藥膠束在pH低于正常組織(pH=7.4)的腫瘤區(qū)(pH=6.5到7.0)能夠釋放出更多的藥物。
　　 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):選擇肝癌細(xì)胞(HepG2)，肺癌細(xì)胞(A549)，卵巢癌細(xì)胞(A2780)以及人正常肝細(xì)胞LO2作為靶細(xì)胞，采用MTT法比較載藥膠束和

15、去甲斑蝥素對(duì)上述腫瘤細(xì)胞的抑制作用，繪制細(xì)胞存活率對(duì)濃度的曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:載藥膠束和去甲斑蝥素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用均呈濃度和時(shí)間依賴性。腫瘤細(xì)胞對(duì)膠束的敏感性高于去甲斑蝥素。相比于去甲斑蝥素，載藥膠束對(duì)A549和A2780的抑制增強(qiáng)作用強(qiáng)于HepG2。用SPSS得到的IC50值同樣能說明相同的問題。載藥膠束在增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的同時(shí)也增強(qiáng)了對(duì)正常肝細(xì)胞LO2的抑制作用。
　　 第五部分:體內(nèi)抗腫瘤活性研究
　　

16、昆明小鼠30只，接種小鼠肉瘤細(xì)胞S180后，隨即分成五組，每組六只。分別為生理鹽水組，陽性對(duì)照組，載藥膠束低劑量組，載藥膠束中劑量組，載藥膠束高劑量組。接腫瘤24h后連續(xù)八天給予尾靜脈注射藥物，并每天用游標(biāo)卡尺測(cè)小鼠腫瘤大小變化。第九天將小鼠處死剝瘤并稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果表明:與裸藥組相比，載藥膠束對(duì)腫瘤抑制作用具有顯著性增強(qiáng)(P＜0.05)，高濃度組載藥膠束的抑瘤率高達(dá)77.63％。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們得到這樣的結(jié)論:聚合物膠束通過