聚乙二醇-殼聚糖-聚乙烯亞胺共聚物的制備及其基因傳遞系統(tǒng)性能的研究.pdf

1、聚合物類基因傳遞載體目前受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，很多學(xué)者認(rèn)為它是一種有希望替代病毒類基因載體進(jìn)入基因治療領(lǐng)域的載體。與病毒類載體相比，聚合物類基因傳遞載體具有低免疫原性、可攜帶較大的DNA片段、儲(chǔ)存穩(wěn)定、適于大批量生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)聚合物進(jìn)行各種修飾改性或結(jié)合配基，可適用于多種給藥方式或靶向給藥。 殼聚糖(Chitosan，CS)作為非病毒類基因載體的研究目前已日趨成熟。作為一種天然的高分子多糖材料，無(wú)論是在體外還是體內(nèi)的應(yīng)用研究，殼

2、聚糖都具有其他陽(yáng)離子類聚合物載體所無(wú)法比擬的低毒性和高度生物相容性。殼聚糖的轉(zhuǎn)染效率與許多因素有關(guān)，包括殼聚糖自身的分子量和脫乙酰度、環(huán)境的pH值和細(xì)胞類型等。但總體來(lái)講，殼聚糖的轉(zhuǎn)染效率不夠高。此外，殼聚糖的特殊分子結(jié)構(gòu)使得它在中性或生理pH值環(huán)境中的溶解性較差。為了提高殼聚糖載體的轉(zhuǎn)染率，可將殼聚糖進(jìn)行水溶性改性，增強(qiáng)殼聚糖與DNA的結(jié)合和在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性；或接入配體，增加殼聚糖載體與靶向細(xì)胞的親和性。 聚乙二醇(pol

3、yethylene glycol，PEG)是常用的生物相容性材料，它不僅能改善其他高分子的水溶性，也能通過(guò)對(duì)納米粒的表面修飾改善其體內(nèi)分布。聚乙二醇是高度親水的柔性鏈，可結(jié)合大量的水分子，形成一層水性的外殼，將納米?！半[藏”在內(nèi)，避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和巨噬細(xì)胞識(shí)別，增加在血液系統(tǒng)中的循環(huán)時(shí)間，因而又有“隱形納米?！焙汀伴L(zhǎng)循環(huán)納米粒”的美稱。聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是目前研究最廣泛而高效的基因傳遞載體。PEI含

4、有大量的氨基，在溶液中攜帶高密度的正電荷，能與DNA形成緊密的納米復(fù)合物，易被細(xì)胞內(nèi)吞。進(jìn)入細(xì)胞后，PEI又能通過(guò)質(zhì)子海綿作用迅速突破內(nèi)涵體，將DNA釋放出來(lái)。盡管PEI有諸多的優(yōu)點(diǎn)，但細(xì)胞毒性是其應(yīng)用中的一大障礙。 目前對(duì)殼聚糖類基因載體的研究多限于報(bào)告基因和基因傳遞系統(tǒng)的動(dòng)物體內(nèi)分布的研究，距離真正的疾病臨床應(yīng)用還有較長(zhǎng)的距離。 本研究以CS為主體，接枝PEG和PEI，合成了一種新型的基因傳遞載體PEG-CS-PEI

5、。這種新載體可將CS、PEG和PEI三者的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合并避免各自的缺點(diǎn)。新載體PEG-CS-PEI與常用的PEI 25K載體對(duì)模型細(xì)胞HeLa具有不同毒性機(jī)制；利用綠色熒光蛋白基因(EGFP)作為報(bào)告基因，兩者具有不同的轉(zhuǎn)染行為。體內(nèi)試驗(yàn)是利用已有三十多年歷史的較為成熟的動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型，及已獲得廣泛公認(rèn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為治療基因，研究PEG-CS-PEI／VEGF基因傳遞系統(tǒng)在動(dòng)物體內(nèi)的有效性。 1聚乙二醇-殼聚

6、糖共聚物的合成與結(jié)構(gòu)表征將分子量5 000的單甲氧醚聚乙二醇的端羥基氧化為醛基，在酸性水溶液中與殼聚糖的氨基生成西弗堿；再用氰硼氫化鈉還原西弗堿，得到聚乙二醇-殼聚糖接枝共聚物。分別用IR和1HNMR表征了中間產(chǎn)物和共聚物。調(diào)整投料比得到不同PEG取代度的共聚物分子，XRD和DSC研究其熱行為和結(jié)晶行為，發(fā)現(xiàn)隨著PEG取代度的增高，共聚物分子逐漸表現(xiàn)為與PEG類似的結(jié)晶性。 2聚乙二醇-殼聚糖共聚物與DNA的結(jié)合試驗(yàn)：篩選最佳P

7、EG接枝率的共聚物動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定結(jié)果證實(shí)，接枝PEG后，CS仍能與DNA通過(guò)靜電相互作用形成納米級(jí)的復(fù)合物微球。PEG取代度對(duì)復(fù)合物納米球尺寸的影響不大，通常都在200nm左右。瓊脂糖凝膠電泳和zeta電位測(cè)定結(jié)果證實(shí)，聚乙二醇．殼聚糖共聚物能夠屏蔽或中和DNA的負(fù)電荷，阻止DNA分子向電場(chǎng)的正極泳動(dòng)。共聚物與DNA的結(jié)合過(guò)程收到PEG取代度的影響，不同PEG取代度的共聚物分子表現(xiàn)出不同的DNA結(jié)合行為。殼聚糖氨基與DNA磷酸基的數(shù)目

8、比(N／P比)是重要的復(fù)合物參數(shù)。N／P比的增高，意味著在聚合物與DNA形成的復(fù)合物中，陽(yáng)離子聚合物含量的增加。試驗(yàn)結(jié)果證明，PEG取代度為3.55％的PEG(3.55)-CS(50K)共聚物分子具有最佳的DNA結(jié)合能力，具體體現(xiàn)在PEG(3.55)-CS(50K)能完全結(jié)合DNA時(shí)所需的聚合物最少(最低阻滯N／P比即LRR值最小)；中和DNA負(fù)電荷最多最快(zeta電位曲線上升最快，值最大)。而較低的PEG取代度對(duì)CS結(jié)晶結(jié)構(gòu)的破壞不

9、夠，不能使CS鏈充分伸展；較高的PEG取代度則由于較多PEG分子的存在而帶來(lái)空間位阻，影響CS與DNA的結(jié)合。 3聚乙二醇-殼聚糖-聚乙烯亞胺共聚物(PCP)的合成與結(jié)構(gòu)表征由于PEG-CS的轉(zhuǎn)染率不理想，為提高載體轉(zhuǎn)染率，設(shè)想將PEI接枝到CS鏈上。首先合成了PEI的單體-氮丙啶，然后在PEG-CS的水溶液中進(jìn)行氮丙啶的陽(yáng)離子聚合反應(yīng)，有一部分氮丙啶單體隨機(jī)碰撞到CS鏈上的氨基并從CS的氨基上長(zhǎng)成PEI鏈段，從而實(shí)現(xiàn)PEI與CS的結(jié)合

10、。PEG-CS-PEI共聚物的結(jié)構(gòu)通過(guò)1HNMR、13CNMR和GPC進(jìn)行了表征。根據(jù)1HNMR譜圖的峰面積計(jì)算每分子CS所接枝PEI的總分子量；共聚物的GPC曲線為一單峰，分子量大于CS和PEG-CS，表明產(chǎn)物為共聚物。 4 PCP共聚物細(xì)胞毒性機(jī)制的探討采用MTT法初步測(cè)定了PCP共聚物的細(xì)胞毒性，并與PEG-CS共聚物和PEI 25K進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，PCP的細(xì)胞毒性與濃度呈正相關(guān)性?？傮w來(lái)講，PCP共聚物比PEG-C

11、S共聚物的細(xì)胞毒性大，提示其毒性主要來(lái)自所含的PEI鏈段。而與PEI 25K相比，PCP共聚物的毒性小，在低濃度時(shí)則更為顯著。光鏡觀察聚合物的細(xì)胞毒性作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同聚合物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響不同。與PEI25K共培養(yǎng)的細(xì)胞，在0.5h后即出現(xiàn)了大面積的細(xì)胞劇烈收縮和破裂現(xiàn)象；而與PCP共培養(yǎng)的細(xì)胞，在較長(zhǎng)時(shí)間后出現(xiàn)局部細(xì)胞皺縮的現(xiàn)象。通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)科常用的Annexin V-PI雙染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PEI 25K導(dǎo)致了大量培養(yǎng)細(xì)

12、胞的壞死，而PCP誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死率則低得多，另有一部分細(xì)胞通過(guò)凋亡途徑死亡，大大減少了對(duì)周圍細(xì)胞的破壞，具有良好的體內(nèi)應(yīng)用前景。 5PCP共聚物／pEGFP的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)合PEI后的PCP載體，與質(zhì)粒結(jié)合的最低阻滯N／P比(LRR)比原料PEG(3.55)-CS(50K)并沒(méi)有明顯增高，仍在N／P比6左右。但所形成復(fù)合物的粒徑由原來(lái)的200nm左右減小到約50個(gè)納米，說(shuō)明PCP共聚物對(duì)DNA結(jié)合能力的提高。以綠色熒光蛋白基因

13、(pEGFP)為報(bào)告基因，重點(diǎn)考察了PCP載體的最佳轉(zhuǎn)染條件和最大轉(zhuǎn)染效率，并與PEG-CS和PEI 25K進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，PCP載體的轉(zhuǎn)染率隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加而增高，當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)間達(dá)到48h時(shí)，轉(zhuǎn)染率達(dá)到了30％，十倍于PEG-CS的轉(zhuǎn)染率。PCP載體在含10％血清培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)染率高于不含血清培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)染率，說(shuō)明PCP載體保持了CS骨架的優(yōu)點(diǎn)。 6 PCP載體介導(dǎo)VEGF基因表達(dá)的體外和體內(nèi)研究對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠

14、電泳檢測(cè)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液的ELISA檢測(cè)，證實(shí)PCP載體介導(dǎo)了攜VEGF基因的質(zhì)粒EGFP-VEGF進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)VEGF mRNA和VEGF蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是利用球囊損傷兔頸動(dòng)脈內(nèi)皮模型，局部保留灌注給予PCP／pEGFP-VEGF基因傳遞系統(tǒng)，觀察兩周后血管內(nèi)膜的新生內(nèi)皮形成情況。HE染色切片和電鏡圖片表明該基因傳遞系統(tǒng)具有促進(jìn)受損內(nèi)皮修復(fù)、抑制內(nèi)膜增生和管腔變窄的作用，證實(shí)PCP載體具有遞送基因、實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)并在體內(nèi)發(fā)揮所需生