新型基因載體-聚乙烯亞胺共聚物的研究.pdf

1、安全高效的基因傳輸載體是實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵之一。陽(yáng)離子聚合物易于合成和改性、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)使其成為非病毒基因載體的一種重要類型；但由于其對(duì)細(xì)胞有正電荷相關(guān)的毒性、轉(zhuǎn)染效率較病毒載體低、缺乏傳輸特異性、尤其在體內(nèi)缺乏有效的手段檢測(cè)靶向傳輸機(jī)制等缺點(diǎn)制約了其在臨床上的應(yīng)用。本論文從提高基因靶向轉(zhuǎn)染效率和確定靶向傳輸機(jī)制出發(fā)，合成了葉酸偶聯(lián)聚乙二醇接枝支化聚乙烯亞胺(FA-PEG-PEI)、單甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亞胺(PEG-PEI

2、)、聚己內(nèi)酯接枝支化聚乙烯亞胺(PCL-g-hy-PEI)、硬脂酸接枝聚乙二醇-線性聚乙烯亞胺(SA-g-PEG-lPEI)以及單分散納米Fe304(SPIO)；利用<'1>HNMR、FT-IR、GPC表征聚合物；TEM、XRD表征了SPIO，磁學(xué)檢測(cè)表明其呈現(xiàn)超順磁性。以FA-PEG-PEI復(fù)合質(zhì)粒DNA(pDNA)在體外進(jìn)行了靶向傳輸及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。PCL-g-hy-PEI與SA-g-PEG-lPEI同時(shí)負(fù)載SPIO和基因后，可作為潛在

3、核磁共振顯像(MRI)可見(jiàn)的基因傳輸雙功能載體。 FA-PEG-PEI與PEG-PEI復(fù)合pDNA后進(jìn)行電位、粒度分析表明其帶正電，粒徑在200～300nm，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明在N/P值為5和10能夠完全阻滯。以hy-PEI(25kDa)與Lipofectamine2000為對(duì)照。FA-PEG-PEI、PEG-PEI復(fù)合編碼熒光光素酶的pGL3-pEINA與編碼綠色熒光蛋白的pAV-EGFP-pDNA對(duì)C6、293T與Hep

4、G2細(xì)胞進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染，分別利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和熒光顯微鏡考察了其轉(zhuǎn)染效果，MTT實(shí)驗(yàn)考察了復(fù)合物的毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明和另外三種復(fù)合物相比，F(xiàn)A-PEG-PEI/pDNA在表達(dá)葉酸受體的C6與293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后表達(dá)的熒光素酶水平高，熒光顯微鏡下觀測(cè)到的熒光強(qiáng)度也高；FA-PEG-PEI對(duì)C6與HepG2細(xì)胞毒性較小，F(xiàn)A-PEG-PEI對(duì)293T細(xì)胞毒性比PEl25kDa、LiDofectamine2000小而比PEG-PEI/

5、大，表明FA-PEG-PEI能夠作為C6細(xì)胞的葉酸介導(dǎo)靶向載體且細(xì)胞毒性小。不同組成的PCL-g-hy-PEI與SA-g-PEG-lPEI通過(guò)O/W乳化發(fā)分別包裹SPIO，TEM觀測(cè)PCL-g-hy-PEI包裹SPIO樣或者空白樣形貌呈膠束狀，而SA-g-PEG-IPEI包裹SPIO樣與空白樣都成囊泡狀。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)粒度分析表明兩種聚合物自組裝空白樣與包裹SPIO樣品粒徑都在150nm左右，包裹SPIO后粒徑有所增大。PCL-g

6、-hy-PEI空白樣zeta．電位在+35mv左右，SA-g-PEG-lPEI為+12mv左右，包裹SPIO后都有一定的降低。磁學(xué)性質(zhì)表明兩種共聚物包裹SPIO后的納米粒子仍呈現(xiàn)出超順磁性。 FA-PEG-PEI/pDNA對(duì)C6，293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染特性表明FA-PEG-PEI能夠作為兩種細(xì)胞的靶向基因傳輸載體；PCL-g-by．PEI與SA-g-PEG-lPEI包裹SPIO后表現(xiàn)出的超順磁性和正電性使其能夠作為潛在的MRJ可見(jiàn)的