新型靶向性聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)基因載體的研制.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文新型靶向性聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)基因載體的研制姓名：李經(jīng)忠申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：余海曹雪濤20040501新型靶向性聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)基因載體的研制博士研究生李經(jīng)忠導(dǎo)師余海教授曹雪濤教授中文摘要基岡治療有三個重要環(huán)節(jié)，即目的基因、轉(zhuǎn)基岡載體和靶細(xì)胞?；鶎鶎?dǎo)入系統(tǒng)是基網(wǎng)治療的核心技術(shù)。目前，應(yīng)用丁基因治療的載體主要有病毒載體系統(tǒng)利1F病毒載體系統(tǒng)。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，是體內(nèi)基因治療的主要I：具，但安全性存在隱患及有免

2、疫原性，體內(nèi)不能反復(fù)應(yīng)辯j。而≈病毒載體具有安全性高、免疫原性低、易于對DNA進(jìn)行操作等優(yōu)點(diǎn)，故人們愈來愈重視人J二合成的非病毒載體的研究，而解決靶向性問題是非病毒中載體中最為關(guān)注的問題，理想的載體系統(tǒng)是能將治療基因輸送到并進(jìn)入特定的靶細(xì)胞，從而能在該細(xì)胞中得到有效表達(dá)，這對于惡性腫瘤基因治療尤為重要。以受體靶向的非病毒載體系統(tǒng)是最常用和有效的策略利用細(xì)胞表面表達(dá)特異性的受體或蛋白，將特定的配體分子或片段與載體連接形成分子偶聯(lián)體，使DN

3、A能靶向性地轉(zhuǎn)到表達(dá)受體的細(xì)胞。同時，針對非病毒載體的缺陷及DNA轉(zhuǎn)移過程中的內(nèi)吞小泡釋放問題、轉(zhuǎn)運(yùn)入核問題，根據(jù)具體情況選擇合適的載體，并對其作迸一步的優(yōu)化、改善以獲得滿意的治療或應(yīng)用效果。目前常用的非病毒載體包括裸DNA，脂質(zhì)體載體及陽離子多聚物型載體等。聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是最常用的剛離子多聚物非病毒載體，PEI可把質(zhì)粒DNA縮合(condense)成數(shù)百納米大小的顆粒通過靜電作用黏附到細(xì)胞表面上

4、，被動內(nèi)吞。PEI在吞噬泡內(nèi)不能降解，同時保護(hù)DNA免受溶酶體降解；另外，PEI有滲透性腫脹效應(yīng)，導(dǎo)致吞噬泡破裂，使DNA進(jìn)入胞漿，并促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞核。本實(shí)驗(yàn)利用PEI作為載體系統(tǒng)的骨架，同時利用FGF受體(fibroblastgrowthfactorreceptorFGFR)和整合素在人多數(shù)腫瘤細(xì)胞和腫瘤新生血管高表達(dá)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)r能與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合的寡肽：堿性細(xì)胞生k岡子(basicfibroblastgrowthfa

5、ctorbFGF)寡肽、靶向丁整合素的RGD寡肽，利川交聯(lián)技術(shù)將寡肽與PEI偶聯(lián)，構(gòu)建r新型的非病毒基剛載體系統(tǒng)以增加其對腫瘤細(xì)胞及其新生血管的靶向性，旨在_Lj]二惡性腫瘤基因治療的研究。研究分兩部分：第一部分，PEI轉(zhuǎn)染參數(shù)的測定及轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化。第二部分，靶向丁FGFR的bFGF寡肽利靶向丁整臺素的RGD寡肽的設(shè)計(jì)與合成，bFGF寡肽／RGD寡肽單靶向的PEI轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及其介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的有效性和靶向性研究；bFGF寡肽和RG