兩親性殼聚糖連接低分子量聚乙烯亞胺為骨架的腫瘤靶向轉基因載體的構建.pdf

1、基因治療的本質是通過基因導入系統(tǒng)將外源基因導入靶細胞,通過遺傳或分子生物學技術糾正或補償基因缺陷和異常,以達到治療疾病的目的。作為一種新的治療手段,基因治療可以克服包括腫瘤、遺傳性疾病、心血管疾病和自身免疫缺陷等多種疾病,目前研究主要集中于腫瘤的治療。基因治療的關鍵是選擇安全且高效的轉基因載體,使目的基因高效作用于特定細胞且細胞毒性較小。轉基因載體有病毒型和非病毒型兩種。聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)因其結構中

2、含有多種氨基,質子化后含豐富電荷而成為研究最為廣泛的一種聚陽離子型非病毒轉基因載體。然而PEI應用于轉基因載體尚存在三個突出問題:第一,轉染效率與細胞毒性存在矛盾:高分子量 PEI轉染效率高,但細胞毒性大;低分子量PEI細胞毒性小,但轉染效率低。第二,體液穩(wěn)定性與穿膜能力存在矛盾:通過增加親水性來增加PEI體液穩(wěn)定性將會降低PEI的穿膜能力,而不利于目的基因遞送。第三,PEI的細胞靶向性差。由于PEI是靠靜電相互作用與細胞結合,因此無法

3、識別并作用于特定細胞。
　　殼聚糖(Chitosan, CS)是一種天然高分子化合物,由甲殼類動物的甲殼素脫乙?；蟮玫?具有高生物相容性和低細胞毒性,也被用作轉基因載體。但殼聚糖在生理條件下溶解度低,且表面電荷少,使其轉染效率低,限制了其作為轉基因載體的應用。
　　整合素是細胞表面受體的主要家族,對細胞和細胞外基質的粘附起介導作用。整合素是由α(120-185kDa)和β(90-110kDa)兩個亞單位形成的異二聚體,已發(fā)

4、現(xiàn)20余種,其中整合素αvβ3在多種腫瘤表面和新生血管內皮細胞中高表達,對腫瘤血管的生成起著重要作用,因此,整合素αvβ3成為抗腫瘤藥物的作用靶點。
　　基于以上分析,本課題首先對殼聚糖 CS進行改性,得到兩親性殼聚糖 N-辛基-N-季銨化殼聚糖OTMCS,然后以其連接低分子量PEI(PEI2KDa),得到高分子量聚乙烯亞胺衍生物OTMCS-PEI。同時將特異親和整合素αvβ3的RGD肽與細胞穿膜肽 TAT(49-57)偶聯(lián),形成

5、具有靶向于腫瘤細胞和提高穿膜效率的雙功能肽RGDC-TAT(命名為R13)。最后,采用雙功能肽R13修飾PEI衍生物OTMCS-PEI,得到新型轉基因載體OTMCS-PEI-R13。
　　本文第一章介紹了聚乙烯亞胺與殼聚糖在轉基因載體中的應用,包括聚乙烯亞胺的結構特性、對其進行不同的修飾得到的各種聚乙烯亞胺衍生物以及殼聚糖的結構特性、研究熱點等。
　　第二章內容為OTMCS-PEI-R13的合成與表征。首先采用固相法制備雙功

6、能肽R13,并通過質譜測定其序列,HPLC測定其相對含量,并采用酶聯(lián)免疫法檢測 R13與整合素αvβ3陽性的Hela細胞和 B16細胞的親和能力。殼聚糖CS依次與正辛醛、N-甲基吡咯烷酮在一定條件下反應得到兩親性殼聚糖N-辛基-N-季銨化殼聚糖OTMCS,進而采用三光氣+琥珀酰亞胺法活化OTMCS并與PEI2KDa連接形成 OTMCS-PEI高分子量衍生物。最后通過交聯(lián)劑 SMCC將 R13按不同摩爾比與OTMCS-PEI偶聯(lián)得到最終產

7、物OTMCS-PEI-R13。各反應產物通過IR或1HNMR進行結構分析。結果表明,成功合成了雙功能肽R13,其純度達到95％,同時,R13表現(xiàn)出良好的腫瘤細胞親和能力。成功合成了兩親性殼聚糖 OTMCS,并采用三光氣+琥珀酰亞胺法活化 OTMCS并交聯(lián) PEI2KDa,最后成功采用 SMCC法將 R13與OTMCS-PEI偶聯(lián)形成最終產物 OTMCS-PEI-R13。紅外、核磁等結構表征表明目的產物修飾度高且純度好,說明合成方法穩(wěn)定、

8、可控。
　　本文第三章考察了OTMCS-PEI和OTMCS-PEI-R13的理化性質。通過測定兩種聚合物在37℃下不同時間點分子量來評價其水解性能;使用激光粒度儀和 Zeta電位測定儀測定其粒徑及表面電位;使用透射電鏡觀察其形態(tài)結構;通過凝膠電泳阻滯分析考察其包裹DNA的能力及對DNA的保護能力;采用 MTT法評價兩種聚合物對Hela細胞、B16細胞的毒性,并與PEI25KDa和PEI2KDa進行比較。結果表明,OTMCS-PEI

9、-R13在37℃條件下可緩慢水解,大約60小時水解為小分子聚合物。與DNA形成的復合物呈類球形,粒徑約150-250 nm,電位適中。OTMCS-PEI與DNA質量比為0.6時可將 DNA完全包裹, OTMCS-PEI-R13-l與DNA質量比為1時將DNA完全包裹,OTMCS-PEI-R13-h與DNA質量比為3時將DNA完全包裹,三者均具有較強DNA縮合能力。同時, OTMCS-PEI可保護DNA抵抗1100μg/mL肝素鈉、3 U

10、 DNase I/μg DNA的DNase I及50%血清的解離,OTMCS-PEI-R13可保護DNA抵抗300μg/mL肝素鈉、23.5 U DNase I/μg DNA的DNase I及50%血清的解離。以上結果表明OTMCS-PEI和OTMCS-PEI-R13均具有很強的DNA保護能力。與高分子量PEI(PEI25 KDa)相比,OTMCS-PEI與OTMCS-PEI-R13的細胞毒性顯著降低,低濃度時與PEI2KDa毒性類似,

11、即使在高濃度時仍保持60%以上細胞活度。
　　本文第四章考察了 OTMCS-PEI/DNA、OTMCS-PEI-R13-l/DNA及OTMCS-PEI-R13-h/DNA復合物體內外轉染。以pEGFP-N2綠色熒光蛋白質粒和pGL3-Control蟲熒光素酶質粒為報告基因,考察兩種復合物在Hela細胞和B16細胞中的體外轉染能力。熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況,生物/化學發(fā)光儀定量檢測蟲熒光素酶表達情況。最后建立腫瘤模型,

12、以 pGL3-Control蟲熒光素酶質粒作為報告基因,考察復合物在體內的分布和表達情況。結果表明,隨著w/w升高,轉染效率也逐漸升高,三種復合物的轉染效率均顯著高于PEI25 KDa,尤其連接R13后,轉染效率更大幅提高。體內試驗表明,復合物在體內的轉染效率同樣優(yōu)于PEI25 KDa,偶聯(lián)R13后,蟲熒光素酶報告基因在腫瘤組織中表達增強,表明R13可明顯改善復合物在體內的分布,可知OTMCS-PEI-R13在體內具有較強腫瘤靶向能力。