水溶性低分子量殼聚糖輻射防護作用的研究.pdf

1、目的：制備水溶性低分子量殼聚糖,并通過細胞實驗對其輻射防護作用的效果進行評價；合成WSC-DTPA,并將其制成納米粒,為研究新型錒系元素的促排藥物提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：通過間歇3h的高溫強堿洗脫法提高殼聚糖的脫乙酰度,再通過乙酸.過氧化氫氧化降解法降低其分子量,制備出水溶性低分子量殼聚糖；采用MTT法檢測不同濃度殼聚糖對4 Gy60Coγ射線照射后大鼠正常肝細胞(BRL)存活率的影響；流式細胞儀PI單染法檢測BRL細

2、胞經(jīng)殼聚糖及4 Gy60Coγ射線共同作用后細胞周期分布的變化；AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒檢測不同濃度殼聚糖對4Gy60Coγ射線照射后BRL細胞凋亡的影響；Flou-3AM檢測上述條件處理前后BRL細胞胞內鈣離子熒光強度的變化；克隆形成實驗分析不同濃度殼聚糖聯(lián)合不同照射劑量對LO2細胞生存率的影響,以多靶單擊數(shù)學模型擬合方程計算不同濃度殼聚糖對各組細胞的保護系數(shù)(PF)并評價其輻射防護效果；通過N-?；磻铣蒞SC-

3、DTPA聚合物,離子凝膠法制備WSC-DTPA納米粒,并對其結構及形態(tài)進行表征。
　　 結果：線性電位滴定法測定經(jīng)間歇3 h高溫強堿洗脫法獲得的殼聚糖的脫乙酰度由原來的79.3％±0.55％提高到了94.1％±0.06％。高效液相色譜法測定了原料殼聚糖的分子量為2.00×105,經(jīng)乙酸-H2O2降解法降解120 min后,殼聚糖的分子量下降為3.26×103。傅里葉變換紅外光譜證明我們確實得到了高脫乙酰度低分子量的殼聚糖。MTT

4、法結果表明,在給藥濃度范圍內(1.56～50μg/mL)低分子量殼聚糖(LMWC)對BRL細胞沒有細胞毒作用,且能夠對抗輻射對BRL細胞生長的抑制,50μg/mL的CS可以使4 Gy60Coγ射線照射后培養(yǎng)24 h BRL,細胞的存活率由77.4％±0.19％提高到90.6％±0.15％(p<0.05),培養(yǎng)48 h BRL細胞的存活率由66.5％±0.19％提高到87.5％±0.16％(p<0.05)。流式細胞儀PI單染法結果表明,4

5、Gy60Coγ射線照射后BRL,細胞的SubG1峰與對照組相比明顯升高(p<0.05),而加入殼聚糖組隨著殼聚糖濃度的升高SubG1峰逐漸降低,藥物濃度為50μg/mL組與單純照射組相比SubG1峰由51.93％±2.11％降至16.91％±1.32％(p<0.05)。流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡、Flou-3AM檢測胞內鈣離子熒光強度的變化,結果表明,殼聚糖能夠抑制BRL細胞凋亡及胞內鈣超載,細胞凋亡率

6、由未加藥時的16.17％±0.38％降至藥物濃度為50μg/mL時的7.09％±0.48％,胞內鈣離子熒光強度由未加藥時的22.83±0.25降至藥物濃度為50μg/mL,時的14.0±0.23,差異均有顯著性(p<0.05)。且細胞凋亡率與胞內鈣離子熒光強度呈良好的線性關系,線性方程為y=1.03x-7.47,R2=0.9994?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果表明,各加藥組的PF值均大于1。以上細胞實驗的結果是一致的,即水溶性低分子量殼聚糖對4 G

7、y60Coγ射線照射后正常肝細胞具有輻射防護作用。紅外光譜及核磁共振氫譜均證實通過N-酰化反應成功合成了WSC-DTPA；納米激光粒度儀測得經(jīng)離子凝膠法制備的WSC-DTPA納米粒平均粒徑為46.5±1.51 nm,PDI=1.0,透射電鏡及掃描電鏡證實其為近球形,粒徑均一。
　　 結論：通過強堿洗脫法及乙酸-過氧化氫氧化降解法成功地制備了水溶性低分子量殼聚糖(D.D=94.1％,降解120 min Mw=3.26×103),且