低分子量PEI接枝大豆蛋白基因載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染性能研究.pdf

1、基因缺失和異常常導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，包括癌癥，心血管疾病，遺傳病等，這些疾病嚴(yán)重危害著人類的生命健康?；蛑委熥鳛橐环N新型的生物治療手段，因其能夠安全、準(zhǔn)確、有效的修正異變基因而備受關(guān)注。然而，如何設(shè)計(jì)適合的載體將目的基因高效、準(zhǔn)確地運(yùn)載到靶細(xì)胞中仍然是目前研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。聚乙烯亞胺(PEI)是普遍應(yīng)用的陽(yáng)離子聚合物基因載體之一，因其質(zhì)子化之后具有高的電荷密度和良好的質(zhì)子緩沖能力。其中，高枝化度后的PEI25 KDa和22 KDa擁有

2、高的轉(zhuǎn)染效率，因而被稱作聚陽(yáng)離子基因載體領(lǐng)域中的“黃金準(zhǔn)則”。但是高分子量PEI細(xì)胞毒性大，生物降解能力差，易與血清蛋白結(jié)合等嚴(yán)重制約了其作為基因載體的應(yīng)用。另一方面，低分子量的PEI盡管細(xì)胞毒性弱，但是轉(zhuǎn)染效率低，有些甚至幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)染效率。為了解決低分子量PEI轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題，近年來(lái)研究人員對(duì)低分子量PEI進(jìn)行了多方面的研究。
　　本論文基于天然大分子大豆分離蛋白為起始原料制備出一類簡(jiǎn)單、可生物降解、高效的的聚陽(yáng)離子基因載體。

3、首先對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行酶解，接著離心和透析純化，得到具有良好水溶性的低分子量大豆蛋白(SP)。將不同低分子量的PEI(600Da，1200Da，1800Da)通過(guò)酰胺化反應(yīng)修飾在大豆蛋白上得到一系列大豆蛋白-PEI復(fù)合產(chǎn)物(SP-PEIs)，分別命名為SP-PEI600，SP-PEI1200，SP-PEI1800。經(jīng)過(guò)紅外和Zeta電位等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同低分子量PEI成功地接枝到大豆蛋白上。通過(guò)酸堿滴定實(shí)驗(yàn)證明聚合物SP-PEIs的質(zhì)子緩

4、沖能力，通過(guò)蛋白吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聚合物SP-PEIs對(duì)血清蛋白的抑制作用。接下來(lái)，復(fù)合物SP-PEIs/DNA的理化性質(zhì)得到進(jìn)一步詳細(xì)研究。
　　聚合物與DNA形成的復(fù)合物具有理想的粒徑和電位有利于其快速進(jìn)入細(xì)胞和提高基因轉(zhuǎn)染。在pH為7.4的生理?xiàng)l件下，SP-PEIs與DNA形成的復(fù)合物隨著N/P質(zhì)量比的增加，復(fù)合物的粒徑逐漸發(fā)生改變，最終會(huì)穩(wěn)定在100-200nm左右，復(fù)合物SP-PEIs/DNA的電位也是隨著N/P質(zhì)量比的增大而

5、增長(zhǎng)。檢測(cè)不同pH下復(fù)合物SP-PEIs/DNA粒徑的變化，發(fā)現(xiàn)其在生理?xiàng)l件下(pH=7.4)可以穩(wěn)定存在，在酸性條件下粒徑發(fā)生明顯變化，該特性有助于復(fù)合物上中的DNA從內(nèi)涵體中逃逸出來(lái)。另外，通過(guò)瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聚合物SP-PEIs對(duì)DNA的壓縮能力，DNaseⅠ降解實(shí)驗(yàn)和肝素置換實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步檢測(cè)聚合物對(duì)DNA的壓縮能力。
　　之后，通過(guò)一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了聚合物SP-PEIs作為基因載體的潛力和優(yōu)勢(shì)。枝化的PEI25K

6、Da作為對(duì)照組，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，在人腎上皮細(xì)胞(293T)、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)共培養(yǎng)中，聚合物SP-PEIs均表現(xiàn)出比對(duì)照組PEI25 KDa更低的毒性及良好的生物相容性。利用流式細(xì)胞儀和熒光倒置顯微鏡檢測(cè)SP-PEIs/DNA復(fù)合物在有血清和無(wú)血清環(huán)境下的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果證明，無(wú)論在有血清和無(wú)血清條件下復(fù)合物SP-PEIs/DNA在SH-SY5Y細(xì)胞系均有較高的轉(zhuǎn)染效率。特別是聚合物SP-PEI1800與DNA在

7、質(zhì)量比為24時(shí)，無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染效率(5.27％)是對(duì)照組(1.94％)的2.7倍，在有血清條件下則高達(dá)3.4倍;而在293T細(xì)胞中，無(wú)血清條件下聚合物SP-PEI1800與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為24的時(shí)候最高轉(zhuǎn)染效率(15.1％)和對(duì)照組的轉(zhuǎn)染效率(16.6％)幾乎相當(dāng);同樣的在有血清狀態(tài)下，聚合物SP-PEI1800(8.19％)也能取得和對(duì)照組類似的轉(zhuǎn)染效率(7.22％)。
　　本論文制備的復(fù)合物SP-PEIs作為新型的基因載體