乳鐵蛋白結(jié)合聚乙二醇聚乳酸納米粒腦內(nèi)遞藥特性的體內(nèi)外研究

1、乳鐵蛋白結(jié)合聚乙二醇聚乳酸納米粒腦內(nèi)遞藥特性的體內(nèi)外研究胡凱莉，李靖煒，沈燁虹陸偉，高小玲蔣新國（復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，上海200032）摘要：目的摘要：目的構(gòu)建一種新型可生物降解腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)乳鐵蛋白結(jié)合聚乙二醇聚乳酸納米粒（LfNP），并對其腦內(nèi)遞藥特性進(jìn)行體內(nèi)外評價。方法方法采用馬來酰亞胺基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基聚乙二醇聚乳酸通過復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備納米粒（NP）將其與巰基化的乳鐵蛋白（Lf）共價連接制得LfNP。采用透射電鏡技術(shù)

2、，免疫電鏡技術(shù)，動態(tài)光散射分析，X射線光電子能譜分析及酶聯(lián)免疫吸附試驗對LfNP的形態(tài)粒徑和表面Lf的連接進(jìn)行鑒定和表征。以香豆素6為熒光探針定性及定量的研究了小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3對LfNP的攝取情況。采用CCK8評價了LfNP對細(xì)胞活力的影響。利用熒光顯微技術(shù)和冷凍切片技術(shù)觀察小鼠尾靜脈注射載香豆素6的LfNP后的腦內(nèi)分布情況并進(jìn)行了藥動學(xué)研究。結(jié)果結(jié)果制得的LfNP形態(tài)圓整，粒徑在110nm左右。免疫電鏡技術(shù)，X射線光

3、電子能譜分析及酶聯(lián)免疫吸附試驗證實了LfNP表面共價連接有Lf，且每個LfNP表面的Lf數(shù)約為55。bEnd.3對LfNP的攝取在37℃，不同濃度和不同孵育時間條件下均顯著高于未結(jié)合納米粒（NP）。靜脈注射載香豆素6的納米粒后，LfNP組小鼠腦內(nèi)香豆素6的量約為NP組的3倍。3mgml的LfNP對bEnd.3細(xì)胞的活力無顯著影響。結(jié)論結(jié)論LfNP能顯著增加藥物的腦內(nèi)遞送且具有較好的生物相容性，有望作為一種新型的腦內(nèi)遞送系統(tǒng)輸送蛋白多肽和

4、基因等大分子藥物入腦。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：乳鐵蛋白；血腦屏障；香豆素6；生物可降解納米粒；腦內(nèi)遞送中圖分類號：中圖分類號：R9基金項目：國家973項目“導(dǎo)向性納米載藥系統(tǒng)及其腦部疾病治療與診斷中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究”作者簡介：胡凱莉，女，博士研究生通訊作者：蔣新國，男，研究員，博士生導(dǎo)師Tel:(021)54237381Email:particleBraindelivery血腦屏障（BBB）在保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受外源性毒物損傷的同時也限制了大多數(shù)

5、神經(jīng)治療藥物入腦，成為腦部疾病治療的最大障礙[1]。大約98%的小分子藥物和幾乎100%的大分子藥物，包括酶，基因和siRNAs等均不能透過BBB[2]。隨著現(xiàn)今腦部疾病發(fā)病率的不斷升高，通過各種給藥系統(tǒng)和靶向策略增加藥物的腦內(nèi)傳遞已成為解決這一問題的關(guān)鍵。局部侵入給藥（腦內(nèi)直接注射滴注）易引發(fā)感染，手術(shù)費(fèi)用高且有效遞藥面積有限[3]。而非侵入給藥借助BBB上存在的內(nèi)源性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以避免破壞血腦屏障并實現(xiàn)廣泛的全腦遞藥[4]。在各種

6、非侵入給藥方式中，利用在BBB上存在特異受體的靶向頭基連接載藥系統(tǒng)得到的受體介導(dǎo)的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)在具有腦靶向功能的同時能夠提高藥物包封率，降低副作用和避免多藥耐藥系統(tǒng)的外排，具有很好的前景[5]。目前最具代表性的受體介導(dǎo)腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)OX–26結(jié)合的免疫脂質(zhì)體成功用于小分子藥物及基因藥物的腦內(nèi)遞送，證實了受體介導(dǎo)途徑優(yōu)良的腦內(nèi)遞藥能力[67]。然而，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差及單克隆抗體效果的不穩(wěn)定限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[810]。因此，腦部疾病的治療仍

7、需開發(fā)新型的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)。乳鐵蛋白是一種陽離子鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，它由690個氨基酸折疊而成兩個球形裂片，各包含一個鐵結(jié)合位點。Lf具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)，抗菌及抗癌等多種生理功能[11]?，F(xiàn)已證明多種生物BBB表面均存在Lf受體（LfR），能夠介導(dǎo)Lf轉(zhuǎn)運(yùn)[1214]。最近Ji等人比較了Tf，OX26和Lf的入腦性能，結(jié)果證實Lf的入腦能力顯著高于前兩者[15]。本試驗利用Lf的腦靶向能力構(gòu)建了受體介導(dǎo)的生物可降解腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)

8、并探索了Lf作為腦靶向頭基的能力。采用聚乙二醇聚乳酸納米粒與Lf連接是基于納米粒相對于脂質(zhì)體的諸多優(yōu)點：具有較好的穩(wěn)定性，處方中輔料種類較少，制備相對簡單，具有一定的緩釋能力便于慢性疾病的治療[16]。此外，聚乙二醇和聚乳酸都是FDA已批準(zhǔn)的輔料，將使載藥系統(tǒng)具有較好的生物相容性和安全性[17，18]。為了評價其腦內(nèi)遞藥特性，以香豆素6為熒光探針定性和定量地研究了小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞對LfNP和NP的攝取及它們在小鼠腦內(nèi)的分布并通過細(xì)