乳鐵蛋白修飾白藜蘆醇納米粒的制備及其腦靶向作用的初步研究.pdf

1、目的：制備乳鐵蛋白修飾的白藜蘆醇納米粒(Lactoferrin modified Resveratrol NanoParticles, Lf-Res-NPs)，考察其在小鼠體內藥物代謝動力學，觀察其對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)模型大鼠的干預作用，初步評價其腦靶向作用。
　　方法：(1)界面聚合法制備白藜蘆醇納米粒(Resveratrol NanoParticles, Res-NPs)，星點設計優(yōu)

2、化處方和工藝，采用羥基聚乙二醇馬來酰亞胺(Hydroxyl-PEG-Maleimide, OH-PEG-MAL)的-OH基團鏈接 Res-NPs，MAL基團與活化后的乳鐵蛋白巰基結合，制備 Lf-Res-NPs，激光粒度分析儀檢測其粒徑，透射電鏡觀察其形態(tài)。(2)SPF級昆明小鼠270只，雄性，隨機分為3組：Res溶液組、Res-NPs組和 Lf-Res-NPs組。常規(guī)飼養(yǎng)1周后腹腔注射給藥，給藥后0.17、0.5、0.75、1、2、6

3、、10、12、24h采血，每個時間點10只小鼠。采用 HPLC法分析血漿及組織中藥物濃度，計算藥代動力學參數和各組織靶向指數。(3)SPF級 SD大鼠50只，雌雄各半，隨機分為正常組、AD模型組、Res溶液組、Res-NPs組和 Lf-Res-NPs組，每組10只。正常組每天腹腔注射生理鹽水和灌胃蒸餾水，其余各組腹腔注射 D-半乳糖150mg/kg-1/d-1和灌胃三氯化鋁10mg/kg-1/d-1，連續(xù)65d。第31d正常組和AD模型

4、組腹腔注射生理鹽水，藥物干預組腹腔注射不同劑型 Res，Res給藥劑量為30mg/kg-1/d-1。造模65d后，Morris水迷宮檢測大鼠認知功能；比色法檢測血清及腦組織中谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活力及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量；免疫組織化學染色觀察海馬β-淀粉樣蛋白1-42(βe

5、ta amyloid peptides1-42, Aβ1-42)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine-containing aspartate-specific protease3, Casepase-3)表達；ELISA法檢測海馬組織 Aβ1-42的表達；Western Bolt檢測海馬β-淀粉樣前體蛋白(βeta-Amyloid precursor protein, APP)、Caspase-3及核轉錄因子-κB(Nucle

6、ar factor-κB, NF-κB)蛋白的表達。
　　結果：(1)①Res-NPs制備最佳處方：油水體積比4.0mL：8.0mL，水相 pH2.0，右旋糖酐-7050mg， Res48mg， BCA52μL。其粒徑(229.02±4.30)nm，載藥量(10.13±0.96)％，包封率(80.36±2.70)％；②在pH7.4 PBS釋放介質中，Res溶液2h累積釋放 Res(80.26±1.61)%，8h累積釋放 Res(8

7、6.16±0.10)%；Res-NPs2h累積釋放Res(56.77±2.47)%，8h累積釋放 Res(73.11±7.14)%，72h累積釋放 Res(80.24±2.78)%；Res-NPs中加入血漿時，2h累積釋放 Res(56.62±0.30)%，8h時累積釋放 Res(82.22±3.22)%，72h累積釋放 Res(87.96±0.72)%；③Lf-Res-NPs粒徑(240±4.652)nm，透射電鏡鑒定 Lf與 Res

8、-NPs成功連接。(2)①藥代動力學結果顯示：與 Res溶液組藥時曲線下面積(AUC(0-∞))、生物半衰期(t1/2z)、達峰時間(Tmax)、達峰濃度(Cmax)和清除率(CLz/F)比較，Res-NPs組和 Lf-Res-NPs組 AUC(0-∞)、t1/2z、Tmax、Cmax增加，CLz/F降低(P<0.05)；與 Res-NPs組比較，AUC(0-∞)、t1/2z、Tmax、Cmax增加，CLz/F降低(P<0.05)；②R

9、es溶液組和 Res-NPs組藥物主要集中在肝和腎組織，Lf-Res-NPs組藥物主要集中在肝、脾和腦組織，給藥120min后Res溶液組腦靶向指數最大值為14.263%，Res-NPs組腦靶向指數最大值為20.980%，Lf-Res-NPs組腦靶向指數最大值為26.879%，其 Lf-Res-NPs組比 Res-NPs組增加1.3倍，比 Res溶液組增加1.9倍；且給藥后10、12、24h Lf-Res-NPs組腦靶向指數顯著高于其余

10、兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。(3)①水迷宮定位航行結果顯示：與正常組比較，AD模型組1-4d逃避潛伏期延長(P<0.05)；與AD模型組比較，不同劑型Res干預的各組2-4d逃避潛伏期縮短(P<0.05)；與 Res溶液組比較，Res-NPs組和 Lf-Res-NPs組在第3-4d逃避潛伏期縮短(P<0.05)；與 Res-NPs組比較， Lf-Res-NPs組在第4d逃避潛伏期縮短(P<0.05)；空間探索結果顯示：與正常

11、組比較，AD模型組穿環(huán)次數和滯留時間減少(P<0.05)；與AD模型組比較，不同劑型Res干預的各組穿環(huán)次數與滯留時間增加(P<0.05)；不同劑型Res組間比較，Lf-Res-NPs組穿環(huán)次數與滯留時間增加(P<0.05)。②與正常組比較，AD模型組血清及腦組織內 SOD和 GXH-PX活力降低，MDA含量升高(P<0.05)；與 AD模型組比較，Res-NPs組和 Lf-Res-NPs組血清及腦組織SOD和GSH-PX活力升高，MD

12、A含量降低(P<0.05)；不同劑型Res組間比較，Lf-Res-NPs組血清及腦組織 SOD和 GSH-PX活力增加，MDA含量降低(P<0.05)。③免疫組化結果顯示：與正常組比較，AD模型組大鼠海馬 Casepase-3和Aβ1-42蛋白表達增加(P<0.05)；與 AD模型組比較，不同劑型 Res干預的各組大鼠海馬 Casepase-3和 Aβ1-42蛋白表達降低(P<0.05)；不同劑型 Res組間比較，Lf-Res-NPs組

13、大鼠海馬Casepase-3和Aβ1-42蛋白表達降低(P<0.05)。④ELISA檢測結果顯示：與正常組比較，AD模型組大鼠海馬 Aβ1-42蛋白表達增加(P<0.05)；與 AD模型組比較，不同劑型 Res干預的各組大鼠海馬 Aβ1-42蛋白表達降低(P<0.05)；不同劑型 Res組間比較，Lf-Res-NPs組大鼠海馬 Aβ1-42蛋白表達降低(P<0.05)。⑤Western bolt結果顯示：與正常組比較，AD模型組大鼠海馬

14、 Casepase-3、NF-κB和 APP蛋白表達增加(P<0.05)；與AD模型組比較，不同劑型Res干預的各組大鼠海馬Casepase-3、NF-κB、APP蛋白表達降低(P<0.05)；不同劑型 Res組間比較，Lf-Res-NPs組大鼠海馬Casepase-3、NF-κB、APP蛋白表達降低(P<0.05)。
　　結論：(1)制備得到粒徑為(240±4.652)nm Lf-Res-NPs。(2)Lf-Res-NPs可延長