乳鐵蛋白修飾生物可降解納米粒的腦內(nèi)遞藥研究.pdf

1、血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)在防止腦內(nèi)環(huán)境受到外界毒物侵害的同時也很大程度上限制了藥物的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運及腦部疾病的治療。以非侵襲性給藥途徑提高藥物腦內(nèi)遞送的研究,因其能夠克服外科手術(shù)所帶來的創(chuàng)傷和危險,已成為國內(nèi)外腦內(nèi)靶向給藥的研究重點。其中尤以通過受體介導轉(zhuǎn)運入腦的微粒遞藥系統(tǒng)的研究最為成功,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體OX26連接的空間穩(wěn)定免疫脂質(zhì)體已被證明可以通過血腦屏障上的特異受體,成功將小分子藥物、蛋白及基

2、因藥物遞送入腦,但OX26為小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體,具有很強的種屬特異性,只能與大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合,還存在嚴重的免疫原性。此外,載藥系統(tǒng)脂質(zhì)體的體內(nèi)外穩(wěn)定性均較差,若載藥系統(tǒng)在未到達腦微血管的吸收部位前解體即會嚴重影響藥物的腦內(nèi)遞送效果。鑒于此,有必要而且也亟需探尋新型的靶向功能分子和載藥系統(tǒng),構(gòu)建更為合理、有效的腦內(nèi)靶向遞藥系統(tǒng)。
　　為了克服以上缺陷,本課題構(gòu)建兩種新型的生物可降解腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)—乳鐵蛋白修飾

3、聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒載藥系統(tǒng)(Lf-NPPLGA)和乳鐵蛋白修飾聚乳酸納米粒載藥系統(tǒng)(Lf-NPPLA)。乳鐵蛋白(Lacto ferrin,Lf)是一種存在于哺乳動物體內(nèi)的陽離子糖蛋白,已有研究證實Lf可以通過受體介導的胞吞轉(zhuǎn)運入腦,且其入腦量顯著高于轉(zhuǎn)鐵蛋白和OX26。Lf-NPPLGA和Lf-NPPLA可借助表面Lf以受體介導胞吞轉(zhuǎn)運方式增加其腦內(nèi)轉(zhuǎn)運;將生物可降解的納米粒作為藥物的載體,不僅安全性好,還能顯著提高藥物的穩(wěn)定性

4、和輸送能力;納米粒采用復乳/溶媒蒸發(fā)法制備,適合于包載水溶性大分子藥物,如蛋白多肽和基因藥物,可以掩蓋其自身的理化性質(zhì),代之以納米粒的特性;納米粒表面經(jīng)PEG修飾,可避免單核巨噬系統(tǒng)的吞噬,延長在血漿中的半衰期,提高血漿藥時曲線下面積(Areaundercurve,AUC),具有長循環(huán)作用。帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,在50歲以上的人群中發(fā)病率達1～2％,目前尚缺乏能夠根治的藥物

5、和手段,臨床仍以對癥治療為主。近年來,神經(jīng)保護藥物的開發(fā)為PD的治療帶來了新的希望。腦內(nèi)注射實驗證明,促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素相關(guān)肽Urocortin(UCN)對大鼠PD模型具有很好的治療效果。但UCN靜脈注射后不能入腦,極大限制了其應(yīng)用。鑒于此,我們采用新型生物可降解腦靶向納米載藥系統(tǒng)Lf-NPPLGA包載UCN進行腦內(nèi)遞送,以期提高對PD的治療效果。
　　本文第一部分，為Lf-NPPLGA的腦內(nèi)遞藥研究。第一章首先由復乳/溶媒

6、蒸發(fā)法制備馬來酰亞胺—聚乙二醇(Maleimide-PEG,MAL-PEG)和甲氧基聚乙二醇(MPEG)表面共修飾的聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)納米粒,然后通過其表面MAL-PEG與巰基化Lf共價連接而制備Lf-NPPLGA。該納米粒的平均粒徑在100nm以下,Zeta電位在-20mV以下。免疫電鏡觀察證實納米粒表面存在具有活性的Lf,Lf-NPPLGA可由表面的Lf通過受體介導的胞吞轉(zhuǎn)運入腦。利用ELISA法測得每個Lf-NPPLG

7、A表面連接的Lf約為42個。以粒徑為指標,最終篩選的優(yōu)化制備條件為:聚合物總量25mg,巰基化試劑2-IT:Lf摩爾比為40:1;外水相為1%的膽酸鈉溶液。
　　第一部分第二章，采用香豆素-6作為納米粒的熒光探針,bEnd.3作為體外BBB模型,以未連接Lf的普通納米粒NPPLGA為對照,對Lf-NPPLGA的腦內(nèi)遞藥特性進行了體外評價。在pH7.0和4.0的條件下,香豆素-6在NPPLGA和Lf-NPPLGA中24h的累積泄漏量

8、均小于3.5%,證實香豆素-6是一種較為理想的納米粒探針,能用以較為準確的示蹤NPPLGA和Lf-NPPLGA體內(nèi)外生物學行為。細胞攝取實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),bEnd.3在15,30和60min時,對Lf-NPPLGA的攝取均顯著高于NPPLGA。攝取抑制實驗的結(jié)果證實,Lf-NPPLGA是由LfR轉(zhuǎn)運入腦,通過穴樣凹陷,包被凹陷和巨胞飲途徑內(nèi)吞,為高爾基體和溶酶體參與的能量依賴過程。細胞活力測定結(jié)果顯示,Lf,NPPLGA和Lf-NPPLGA

9、濃度高達3mg/mL時均對細胞活力沒有顯著影響。以上體外實驗證明,Lf-NPPLGA是一種具有腦內(nèi)遞藥特性且毒性較低的藥物傳遞系統(tǒng)。
　　第一部分第三章，以香豆素-6作為Lf-NPPLGA的熒光探針,NPPLGA作為對照,采用藥動學方法考察了Lf-NPPLGA小鼠腦內(nèi)遞送特性。結(jié)果顯示,Lf-NPPLGA在腦中的AUC是NPPLGA的2.49倍,在血中AUC為NPPLGA的1.14倍,與NPPLGA相比較其腦靶向指數(shù)為2.19。組

10、織分布結(jié)果表明,兩種納米粒主要在肝脾聚集,與NPPLGA相比,Lf-NPPLGA在心和脾的分布增多,但在腎的分布減少。小鼠尾靜脈注射60mg/kg載香豆素-6的Lf-NPPLGA和NPPLGA1h后,腦組織切片顯示,Lf-NPPLGA在黑質(zhì)區(qū),紋狀體區(qū)及大腦皮質(zhì)區(qū)的綠色熒光顆粒分布均顯著高于NPPLGA。單核—巨噬細胞特異性染色結(jié)果顯示,高劑量Lf-NPPLGA不引起B(yǎng)ALB/c鼠大腦、小腦、心和肺的巨噬細胞增多,僅對肝、脾和腎產(chǎn)生一過

11、性的輕微毒性。以上體內(nèi)評價結(jié)果證實,Lf-NPPLGA具有一定的腦內(nèi)遞藥特性,并且是一種毒性較低的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)。
　　第一部分第四章，建立了單側(cè)損毀的急性6-OHDAPD大鼠模型及慢性魚藤酮PD大鼠模型。采用Lf-NPPLGA包載UCN多肽,通過行為學、免疫組織化學、神經(jīng)遞質(zhì)的代謝產(chǎn)物三方面指標考察了Lf-NPPLGA-NUC對于兩種PD大鼠模型的治療作用。結(jié)果表明,高劑量的Lf-NPPLGA-NUC對于6-OHDA和魚藤酮PD模

12、型大鼠的行為都有顯著的改善作用,并能提高紋狀體內(nèi)TH和DA的含量,顯著優(yōu)于同等劑量的未修飾納米粒NPPLGA-NUC。以上結(jié)果充分證實Lf-NPPLGA是一種有效的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng),為具有腦內(nèi)治療活性藥物,特別是穩(wěn)定性差、難以通過血腦屏障的蛋白多肽藥物腦內(nèi)遞送提供了有效手段。
　　本文第二部分為Lf-NPPLA的腦內(nèi)遞藥研究。第一章，設(shè)計并制備了Lf-NPPLA腦靶向納米載藥系統(tǒng)。Lf-NPPLA的平均粒徑在150nm以下,Zeta電

13、位為-20mV左右。X射線光電子能譜對Lf-NPPLA的表面元素分析結(jié)果顯示,Lf-NPPLA表面的N元素來自于Lf,證實NPPLA與Lf共價連接的存在。免疫電鏡觀察結(jié)果進一步證實Lf-NPPLA表面存在Lf,并從另一個角度證實Lf-NPPLA可由表面的Lf通過受體介導的胞吞轉(zhuǎn)運入腦。利用ELISA法測得MAL-PEG-PLA:MPEG-PLA和Lf-SH:MAL-PEG-PLA為不同比例時,Lf-NPPLA表面連接的Lf的量。以粒徑和

14、表面Lf的量為指標,最終篩選的優(yōu)化制備條件為:MPEG-PLA:MAL-PEG-PLA質(zhì)量比為9:1;巰基化試劑2-IT:Lf摩爾比為40:1;MAL-PEG-PLA:巰基化蛋白摩爾比為3:2;反應(yīng)時間為9h。
　　第二部分第二章，以香豆素-6作為熒光探針,對Lf-NPPLA的腦內(nèi)遞藥特性進行了體外評價。結(jié)果顯示,pH7.0和4.0的條件下,香豆素-6在NPPLA和Lf-NPPLA中24h的累積泄漏量均小于6%,證實香豆素-6能用

15、以較為準確的示蹤其體內(nèi)外的生物學行為。小鼠腦毛細血管內(nèi)皮細胞bEnd.3攝取載香豆素-6的NPPLA和Lf-NPPLA的定性觀察結(jié)果顯示,bEnd.3在30,60和120min時,對Lf-NPPLA的攝取均顯著高于NPPLA。攝取抑制試驗的結(jié)果證實了Lf-NPPLA可以通過Lf介導的胞吞轉(zhuǎn)運過程被攝取,通過包被凹陷和巨胞飲途徑內(nèi)吞,為高爾基體參與的能量依賴過程。細胞活力測定結(jié)果顯示,3mg/mL的Lf,NPPLA和Lf-NPPLA對細胞

16、活力均沒有顯著影響。以上體外實驗證明,Lf-NPPLA可以借助Lf經(jīng)由受體介導的胞吞轉(zhuǎn)運入腦,是一種具有腦內(nèi)遞藥特性且毒性較低的藥物傳遞系統(tǒng)。
　　第二部分第三章，以香豆素-6作為Lf-NPPLA的熒光探針,以NPPLA作為對照,采用藥動學方法考察了Lf-NPPLA小鼠腦內(nèi)遞藥的特性。小鼠尾靜脈注射60mg/kg載香豆素-6的Lf-NPPLA和NPPLA1h后,腦組織切片顯示,Lf-NPPLA第三腦室室周區(qū),紋狀體區(qū)及大腦皮質(zhì)區(qū)的

17、綠色熒光顆粒分布均顯著高于NPPLA。Lf-NPPLA在腦中的AUC是NPPLA的2.98倍,在血中AUC為NPPLA的0.92倍,Lf-NPPLA的腦靶向指數(shù)為3.22。組織分布結(jié)果表明,兩種納米粒主要在肝脾聚集,與NPPLA相比,Lf-NPPLA在肝、脾和腎的分布顯著增多。單核—巨噬細胞特異性染色結(jié)果顯示,高劑量Lf-NPPLA對BALB/c鼠不引起大腦、小腦、心、腎和肺的巨噬細胞增多,僅對肝和脾產(chǎn)生輕微的一過性毒性。
　　本

18、文第三部分制備了包載牛血清白蛋白(BSA)的Lf-NPPLGA和Lf-NPPLA,比較了兩種納米載藥系統(tǒng)在體外的釋放和降解情況,并對它們的腦內(nèi)遞藥性能進行了比較。體外釋放試驗結(jié)果表明,在37℃的PBS兩者釋放行為相似,均符合Weibull分布,15天的累積釋放百分率在45%左右。在含有血漿的PBS中,Lf-NPPLGA和Lf-NPPLA的釋放均有所加快,15天的累積釋放百分率分別達到88%和61%,Lf-NPPLGA的釋放已比較完全。以