轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的新型多聚物載藥納米粒的研制及靶向逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的體外研究.pdf

1、目的：為了增加抗腫瘤藥物的主動靶向性，降低藥物毒副作用，同時克服白血病的多藥耐藥(MDR)，我們研制了一種既能特異性定位于腫瘤細胞膜受體又能阻止藥物外排的新型多聚物載藥納米?！D(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)修飾的共載化療藥物柔紅霉素(DNR)和中藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑漢防己甲素(Tet)的聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸-聚乙二醇(PLGA-PLL-PEG)多聚物納米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf。
　　方法：合成PLGA-PLL-PEG多聚

2、物并進行結(jié)構(gòu)分析，以單載DNR的多聚物納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG為先行試驗基礎(chǔ)，摸索合成工藝，進一步制備共載DNR及Tet的多聚物納米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG，最后共價連接腫瘤細胞膜表面高表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的靶向配體Tf,形成靶向腫瘤細胞的載藥多聚物納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf及DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf。通過核磁共振氫譜、激光粒度儀、高效液相色譜儀、凝膠滲透色

3、譜、高分辨掃描電鏡等對制備的納米粒進行物理表征，通過體外透析試驗了解載藥納米粒的釋藥特性，采用藥物抑制試驗評估空白納米粒的安全性以及載藥納米粒在體外對人白血病敏感細胞株K562細胞和耐藥細胞株K562/ADR細胞的抑制作用，流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡率和細胞內(nèi)DNR的含量，熒光顯微鏡觀察柔紅霉素在細胞內(nèi)的分布，qRT-PCR和Western blotting分析TfR基因和蛋白、mdrl/P-gp以及凋亡相關(guān)基因和蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達。

4、>　　結(jié)果：1、成功合成的PLGA-PLL-PEG多聚物產(chǎn)率較高(61±14％)、結(jié)構(gòu)明確。以其作為載體制備的靶向載藥多聚物納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf,掃描電鏡下呈球形或近似球形，粒徑分別為229±19 nm和213±12 nm，Zeta電位分別為-18.74±0.28 mV和-19.16±0.31 mV。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf的DNR載藥量為5.21±0

5、.11％，Tf含量為2.43±0.26％;DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的載藥量分別為DNR3.63±0.15％和Tet4.27％±0.12％，Tf含量為2.18％±0.11％。Tf偶聯(lián)反應(yīng)前后藥物含量測定結(jié)果顯示:反應(yīng)過程中納米載體所攜載的藥物穩(wěn)定，沒有泄漏現(xiàn)象。體外釋放實驗顯示:DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf、DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的藥物釋放呈雙相性模式，在最初8h存在突釋現(xiàn)象，分別釋

6、放出52.93±3.76％的DNR，50.47±3.74％的DNR和47.86±2.42％的Tet，此后呈現(xiàn)良好的緩釋特征，釋放時間超過一周。
　　2、對于敏感細胞株K562細胞，靶向載藥納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和DNR的抑制作用均隨著濃度的增加而增強，DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf的IC50值低于DNR(0.91±0.10μg/ml vs1.31±0.24μg/ml)，差異有統(tǒng)計學意義。DNR-PLG

7、A-PLL-PEG-Tf和DNR對K562細胞的凋亡率分別為50.24±3.40％和40.78±1.10％，顯著高于Con組(P＜0.05)，DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf誘導(dǎo)細胞凋亡的能力較DNR強(P＜0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf和 DNR處理K562細胞后，細胞胞漿胞核均可見較多的DNR分布及明顯細胞凋亡的特征性改變，如核固縮、核碎裂、核溶解。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf能顯著上調(diào)K562細

8、胞tfr基因的轉(zhuǎn)錄及TfR蛋白表達(P＜0.05)。
　　3、對于耐藥細胞株K562/ADR細胞，無論DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf或是DNR和Tet的混合水溶液(DNR/Tet)的抑制作用亦均隨著濃度的增加而增強，DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf的IC50值(為DNR和Tet的總藥量之和)低于DNR/Tet(0.87±0.01μg/ml vs1.47±0.15μg/ml)，差異有統(tǒng)計學意義。

9、　　加入耐藥逆轉(zhuǎn)劑Tet后，DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf較DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf能顯著增加細胞凋亡率(58.21±2.71％ vs8.84±0.24％)及細胞內(nèi)DNR濃度(RFI:37.96±0.42 vs16.37±0.64)(P＜0.05)。與DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG相比，載體經(jīng)Tf修飾后，DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf更能增加細胞凋亡率(58.21±2.71％ vs

10、33.41±3.03％)及細胞內(nèi)DNR濃度(RFI:37.96±0.42 vs27.19±1.17)(P＜0.05)。
　　DNR-PLGA-PLL-PEG組、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組和DNR組中DNR主要分布于細胞漿，DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG組、DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf組和DNR/Tet組中DNR主要分布在細胞漿和細胞核內(nèi)。DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG、DNR/T

11、et-PLGA-PLL-PEG-Tf、DNR/Tet組細胞中均可見到細胞凋亡的特征性改變，如核固縮、核碎裂、核溶解。
　　DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf能顯著上調(diào)K562/ADR細胞tfr基因的轉(zhuǎn)錄和TfR蛋白表達(P＜0.05);下調(diào)K562/ADR細胞mdrl mRNA的轉(zhuǎn)錄和P-gp的表達(P＜0.05);上調(diào)Caspase3和Bax的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(P＜0.05)，下調(diào)Bcl-2、Survivin和NF

12、-κB的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1、合成的多聚物納米粒PLGA-PLL-PEG可攜載多種藥物，末端經(jīng)Tf修飾，可形成具有主動靶向性能的納米載體PLGA-PLL-PEG-Tf,粒徑均一并具有緩釋特點。
　　2、單載柔紅霉素的靶向載藥納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf對人白血病敏感細胞株K562細胞有明顯的細胞毒性，可能通過細胞內(nèi)吞作用將藥物轉(zhuǎn)運至胞漿內(nèi)，并緩慢釋放藥物進入細胞核從而誘導(dǎo)凋亡。同

13、時可能通過上調(diào)細胞表面tfr的基因轉(zhuǎn)錄和TfR蛋白表達，進一步促進TfR介導(dǎo)的藥物內(nèi)吞作用。
　　3、共載柔紅霉素和漢防己甲素的靶向載藥納米粒DNR/Tet-PLGA-PLL-PEG-Tf在體外對人白血病耐藥株K562/ADR細胞有生長抑制作用，可通過下調(diào)細胞mdrl/P-gp表達減少DNR的外排作用增加藥物蓄積，上調(diào)Bax/Bcl-2比值和Caspase3的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達、下調(diào)Survivin和NF-κB的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達