聚乙二醇化羥基喜樹堿轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾隱形納米載藥系統(tǒng)的腫瘤靶向研究.pdf

1、惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的最主要疾病之一，其發(fā)病率逐年遞增，發(fā)病率和死亡率在各種疾病中均位居第二。盡管人類在過(guò)去的幾十年對(duì)腫瘤生理進(jìn)行了深入的探索，促進(jìn)了腫瘤診斷和治療的發(fā)展，但是多數(shù)抗腫瘤藥物由于自身理化性質(zhì)缺陷，無(wú)法有效富集于腫瘤以及強(qiáng)毒副作用，使其臨床應(yīng)用受到很大的限制。靶向腫瘤納米給藥系統(tǒng)的發(fā)展為癌癥的診斷和治療開啟了一扇新的大門。其中，藥物聚合物納米載體系統(tǒng)由于其良好的可調(diào)控性、易于表面修飾、較高的藥物包封率、較強(qiáng)的

2、藥物保護(hù)作用、釋藥機(jī)理的可控性和適于大規(guī)模生產(chǎn)，已成為研究熱點(diǎn)之一。
　　 本課題通過(guò)藥劑學(xué)、高分子材料學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)等手段的交叉應(yīng)用，以羥基喜樹堿(HCPT)為模型藥物，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)為靶向頭基，首先制備載HCPT的主動(dòng)靶向隱形納米載藥系統(tǒng)，將聚乙二醇(PEG)修飾的隱形化效果與Tf修飾的主動(dòng)靶向作用相結(jié)合，有效遞送藥物到達(dá)腫瘤部位。為了進(jìn)一步降低藥物的毒副作用、提高和延長(zhǎng)藥效，本課題繼而將HCPT聚乙二醇化制成分子

3、共軛物(PEG-HCPT)，包載入轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾主動(dòng)靶向納米載藥系統(tǒng)，探討其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，持續(xù)釋放藥物，結(jié)合PEG化納米載藥系統(tǒng)的被動(dòng)靶向和Tf受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向作用，進(jìn)一步提高抗腫瘤藥效的可能性。
　　 第一章以叔丁氧羰基保護(hù)氨基聚乙二醇(t-Boc-NH-PEG5000-OH)為原料制備功能性材料氨基聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(NH2-PEG-PHDCA)，同法合成對(duì)照材料甲氧基聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(MeP

4、EG-PHDCA)和聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PHDCA)。采用1H-NMR，13C-NMR和FT-IR法確證各聚合物的結(jié)構(gòu)。GPC法測(cè)得的分子量與理論值接近，聚合物多分散性指數(shù)均小于1.4，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。DSC法測(cè)定熔融溫度和熔融焓。
　　 第二章以NH2-PEG-PHDCA為表面修飾材料，共價(jià)連接氧化的Tf，采用薄膜水化-超聲分散法制備載HCPT主動(dòng)靶向隱形納米泡囊(Tf-PEG-NS)，以粒徑、表面連接Tf的個(gè)數(shù)和蛋白

5、連接效率為指標(biāo)，篩選并確定優(yōu)化制備條件為Tf：PEG=1:2，反應(yīng)時(shí)間12h。制得的Tf-PEG-NS粒徑為(115.4±9.1)nm，Zeta電位為(3.76±0.03)mV，包封率為(93.00±0.38)％，載藥量為(2.74±0.01)％，PEG鏈表面密度為0.45個(gè)PEG/nm2，平均每個(gè)泡囊表面連接有59個(gè)Tf，在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中具有一定的緩釋作用，60h釋放達(dá)90％。
　　 與市售注射劑、普通泡

6、囊(non-NS)和PEG修飾泡囊(PEG-NS)相比，Tf-PEG-NS對(duì)KB、K562、S180三種腫瘤細(xì)胞毒性最強(qiáng)。KB細(xì)胞對(duì)Tf-PEG-NS的攝取呈現(xiàn)濃度與時(shí)間依賴性，且在低溫條件或者過(guò)量Tf的存在下，攝取受到抑制，表明Tf-PEG-NS的攝取是能量依賴、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。體外亞細(xì)胞器(包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核)藥物經(jīng)時(shí)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Tf-PEG-NS細(xì)胞核內(nèi)攝取量最高，孵育12h時(shí)，Tf-PEG-NS的核內(nèi)相對(duì)攝

7、取量分別為注射劑、non-NS和PEG-S的79、5.9和1.7倍。載藥泡囊傾向于分布于細(xì)胞核內(nèi)，而HCPT更傾向于分布于細(xì)胞漿，且維持在低濃度水平。
　　 進(jìn)一步考察三種泡囊在SD大鼠的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，結(jié)果顯示PEG修飾隱形納米泡囊能顯著延長(zhǎng)藥物滯留于血液循環(huán)的時(shí)間。Tf-PEG-NS與PEG-NS分別將HCPT的t1/2β由0.91 h延長(zhǎng)至10.39h和11.32 h，AUC分別為non-NS的3.91、4.30倍，為注射

8、劑的7.49、8.23倍，但兩者的t1/2β、AUC、MRT無(wú)顯著性差異。S180荷瘤小鼠組織分布和抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Tf-PEG-NS腫瘤峰濃度最高(分別為HCPT注射液、non-NS和PEG-NS的4.00，2.83和1.51倍)、腫瘤蓄積量最大(分別為HCPT注射液、non-NS和PEG-NS的16.97，3.32和1.45倍)、抗腫瘤活性最強(qiáng)(抑瘤率分別為HCPT注射液、non-NS和PEG-NS的2.40，2.00和1.

9、55倍)，充分顯示了被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向結(jié)合的優(yōu)越性。
　　 第三章以MePEG2000-COOH為?；噭?，選擇性酯化HCPT的10-OH合成PEG-HCPT共軛物。產(chǎn)物以TLC、1H-NMR和FT-IR表征，確證結(jié)構(gòu)。采用強(qiáng)酸水解-HPLC分析法測(cè)得產(chǎn)物的純度>98％。MALDI-TOF質(zhì)譜儀測(cè)得產(chǎn)物的絕對(duì)分子量為2500.56，確證1分子MePEG-COOH與1分子HCPT反應(yīng)。藥物PEG化后，水溶性顯著增強(qiáng)，化合物在酸性條

10、件下穩(wěn)定，于腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期暴露(72h)，毒性與原藥相當(dāng)，為下一步制備載藥系統(tǒng)提供物理、化學(xué)和生物學(xué)依據(jù)。
　　 第四章采用復(fù)孚L/溶媒蒸發(fā)法制備載PEG-HCPT共軛物的轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾隱形納米粒。制得的PEG-HCPT/Tf-PEG-NP粒徑為(109.8±5.3)nm，包封率為(56.63±1.02)％，載藥量以HCPT計(jì)為(2.73±0.03)％，平均每個(gè)納米粒表面連接有59個(gè)Tf。Tf-PEG-NP的Zeta電位為(-11.

11、79±0.18)mV，低于Tf-PEG-NS；其PEG鏈表面密度顯著高于Tf-PEG-NS。在PBS(pH7.4)中緩釋作用明顯，72h釋放小于60％。
　　 PEG-HCPT/Tf-PEG-NP孵育24h的細(xì)胞毒性低于HCPT/Tf-PEG-NS；孵育時(shí)間延長(zhǎng)至48h時(shí)，兩者的細(xì)胞毒性相當(dāng)。PEG-HCPT/Tf-PEG-NP在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中藥物濃度持續(xù)緩慢增加，孵育48h時(shí)細(xì)胞核內(nèi)藥物相對(duì)攝取量顯著高于其他系統(tǒng)，分別為HC

12、PT/Tf-PEG-NS、PEG-HCPT/PEG-NP和PEG-HCPT/non-NP的1.61、1.38和3.72倍。而HCPT/Tf-PEG-NS的細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)藥物濃度均在12h達(dá)峰后下降。深入探討載體系統(tǒng)的細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。結(jié)果表明轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的納米載體系統(tǒng)可通過(guò)網(wǎng)格蛋白有被小窩和細(xì)胞膜穴樣凹陷依賴性內(nèi)吞途徑為KB細(xì)胞所攝取，后經(jīng)溶酶體途徑和高爾基體的運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 無(wú)論是大鼠血漿藥動(dòng)學(xué)、荷瘤小鼠腫瘤

13、靶向性評(píng)價(jià)，還是抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，PEG-HCPT/Tf-PEG-NP均表現(xiàn)出卓越的載藥系統(tǒng)特性。表面高PEG鏈密度賦予其顯著延長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間(t1/2β長(zhǎng)達(dá)20.92h)，有利于增強(qiáng)EPR效應(yīng)被動(dòng)富集于腫瘤部位。PEG-HCPT/Tf-PEG-NP與PEG-HCPT/PEG-NP的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)顯著性差異，但是Tf修飾的主動(dòng)靶向作用使PEG-HCPT/Tf-PEG-NP在腫瘤部位的峰濃度最高，為PEG-HCPT/PEG-NP的1.66倍

14、；蓄積量最大，為PEG-HCPT/PEG-NP的2.12倍；te值最大，表明其對(duì)腫瘤組織的選擇性最強(qiáng)。由于載PEG-HCPT共軛物納米粒的緩慢釋藥，使PEG-HCPT/Tf-PEG-NP在給藥24h時(shí)的藥物濃度為HCPT/Tf-PEG-NS的2.51倍。PEG修飾的隱形化效果、Tf修飾的主動(dòng)靶向作用和納米粒包裹PEG化藥物持續(xù)釋藥三個(gè)方面共同作用的結(jié)果使PEG-HCPT/Tf-PEG-NP具有最強(qiáng)的抗腫瘤效果，抑瘤率達(dá)93.43％，分別