pH調(diào)控法制備載羥基喜樹(shù)堿棒狀納米靶向給藥系統(tǒng)及性能研究.pdf

1、目前，在大部分給藥納米粒子制備方法中，疏水基團(tuán)是必需的，因此這些制備方法都非常依賴于有機(jī)溶劑。而這些有機(jī)溶劑通過(guò)減壓蒸餾或者凍干等傳統(tǒng)方法是無(wú)法完全除去的，即使是透析也無(wú)法完全去除包裹在納米粒子之內(nèi)的殘留溶劑，這樣在納米粒子內(nèi)就會(huì)不可避免的存在殘留有機(jī)溶劑。殘留溶劑不僅對(duì)人體的健康有害，而且會(huì)加速藥物制劑的變質(zhì)失效。因此，如何減少或去除藥物制劑中的殘留溶劑一直是人們關(guān)注的問(wèn)題。
　　羥基喜樹(shù)堿(HCPT)和甲氨喋呤(MTX)都是臨

2、床常用的抗腫瘤藥物，二者作用機(jī)制不同，羥基喜樹(shù)堿是通過(guò)作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ來(lái)抑制DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和有絲分裂，而甲氨喋呤則是通過(guò)與二氫葉酸還原酶結(jié)合，干擾輔酶F的合成，從而抑制DNA的復(fù)制。二者聯(lián)合用藥能夠產(chǎn)生非常好的協(xié)同作用，共同殺傷細(xì)胞。此外，甲氨喋呤還能夠與癌細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的葉酸受體相結(jié)合，介導(dǎo)納米粒子的特異性細(xì)胞攝取，從而產(chǎn)生一定的靶向性。因此將二者共同負(fù)載到一個(gè)納米粒上，能夠使納米粒既具有非常好的協(xié)同作用，又能有一定的靶向

3、性。
　　非球形納米粒子受到越來(lái)越多的關(guān)注，因其具有與球形粒子完全不同的體內(nèi)和體外性質(zhì)，尤其是高縱橫比納米粒子，實(shí)驗(yàn)證明，高縱橫比納米粒子的細(xì)胞攝取速率要大于球形的納米粒子的細(xì)胞攝取速率，因此構(gòu)建一種高縱橫比的給藥納米粒子也許就能夠提供一種新型的高效抗腫瘤制劑。
　　本文以殼聚糖為藥物載體，以羥基喜樹(shù)堿為模型藥物，采用pH調(diào)控聯(lián)合超聲法制備出了葉酸修飾的和甲氨喋呤修飾的羥基喜樹(shù)堿納米棒，整個(gè)制備過(guò)程沒(méi)有使用任何的有機(jī)溶劑，消

4、除了納米粒殘留溶劑問(wèn)題。并考察了制備條件對(duì)其兩種粒子形貌的影響，并對(duì)兩種納米棒粒子的性質(zhì)進(jìn)行了表征，最后對(duì)它們的體內(nèi)和體外抗腫瘤效果進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果如下:
　　(1)葉酸修飾的羥基喜樹(shù)堿納米棒(HFNDs)的制備。首先合成了殼聚糖-葉酸復(fù)合物(CS-FA)，并進(jìn)行了紅外圖譜的表征，證明的酰胺鍵的生成。將CS-FA溶于醋酸溶液，HCPT溶于氫氧化鈉溶液，在超聲冰浴的條件下，將兩溶液混合，制備出了葉酸修飾的羥基喜樹(shù)堿納米棒(HFN

5、Ds)。進(jìn)行了制備條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化條件投料比為1∶1，濃度為10μg/mL，溫度為4-6℃，反應(yīng)最終溶液pH=7，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為3s，間隙3s，冰浴條件下反復(fù)150次。根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)優(yōu)化條件下制備的HFNDs的粒徑、Zeta電位、載藥量、包封率、形態(tài)、HCPT的存在狀態(tài)進(jìn)行分析。結(jié)果表明:通過(guò)pH值調(diào)控成核法制備的HFNDs納米粒子具有均一的形貌和大小。形狀為棒，長(zhǎng)度約為800 nm，寬約為80nm，動(dòng)態(tài)光散

6、射分析其平均水化動(dòng)力學(xué)粒徑為104.3±5.7nm，且粒徑分布較窄，表面電勢(shì)為+(16.3±1.9) mv。HFNDs的載藥量為70.2±3.1％，包封率為83.1％，且緩釋效果良好，在pH=7.4的緩沖溶液能夠在48h內(nèi)緩慢的釋放藥物。
　　(2)體外及體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)。體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明，HeLa細(xì)胞對(duì)HFNDs的細(xì)胞攝取的速率大大快于未經(jīng)葉酸修飾的羥基喜樹(shù)堿-殼聚糖納米棒(NDs)。活體熒光成像結(jié)果表明HFNDs在腫瘤部

7、位的藥物濃度要高于NDs，以上兩組實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，HFNDs具有非常好的靶向性，能夠很好的在腫瘤部位富集。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，HFNDs對(duì)HeLa的細(xì)胞毒性比NDs對(duì)HeLa的細(xì)胞毒性要明顯大的多。小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，HFNDs的體內(nèi)抗癌效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于相同藥物劑量下的市售制劑以及NDs，以上兩組試驗(yàn)則表明，葉酸的引入大大提高了HFNDs的抗腫瘤效果。
　　(3)雙載藥納米棒粒子(MHNDs)的制備。首先合成了殼聚糖-甲氨喋呤復(fù)合物(C

8、S-MTX)，進(jìn)行了紅外圖譜的表征，證明的酰胺鍵的生成，并通過(guò)紫外分光光度法，計(jì)算出MTX的百分含量為28.6±1.7％。將CS-MTX溶于醋酸溶液，HCPT溶于氫氧化鈉溶液，在超聲冰浴的條件下，將兩溶液混合，制備出了雙載藥納米棒粒子(MHNDs)。并對(duì)制備的MHNDs的粒徑、Zeta電位、載藥量、包封率、形態(tài)、HCPT的存在狀態(tài)進(jìn)行分析。結(jié)果表明:通過(guò)pH值調(diào)控成核法制備的MHNDs納米粒子形貌與HFNDs形貌非常類似，同樣為棒狀的納

9、米粒子，長(zhǎng)度約為600 nm，寬約為80nm，動(dòng)態(tài)光散射分析其平均水化動(dòng)力學(xué)粒徑為101.0±5.8 nm，且粒徑分布較窄，表面電勢(shì)為+(21.4±2.1) mv。MHNDs的HCPT的載藥量為68.8±2.5％，包封率為80.1％，MTX的載藥量為8.9±0.3％。MHNDs的緩釋效果良好，能夠在48 h內(nèi)緩慢的釋放藥物。
　　(4)體外及體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)。體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明，HeLa細(xì)胞對(duì)MHNDs的細(xì)胞攝取的速率大大快于

10、NDs。葉酸競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)表明，在葉酸存在條件下，MHNDs的細(xì)胞攝取明顯下降，說(shuō)明MHNDs是通過(guò)與葉酸受體的特異性結(jié)合介導(dǎo)的特異性吞噬進(jìn)入細(xì)胞的。活體熒光成像結(jié)果表明MHNDs在腫瘤部位的藥物濃度要高于NDs，以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，MHNDs同樣具有非常好的靶向性，能夠很好的在腫瘤部位富集。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明MHNDs的細(xì)胞毒性不僅大于兩種藥物理混合物的細(xì)胞毒性，也強(qiáng)于NDs與甲氨喋呤的混合物的細(xì)胞毒性。小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明，雙載藥納米棒